Tyrosine phosphorylation of neuropeptide Y (NPY) by a secreted protein kinase Vlk affects the receptor binding affinity of NPY

Abstract

Phosphorylation of intracellular proteins is a fundamentally important regulatory mechanism in cell signaling. According to phospho-proteomic datasets, an extensive list of extracellular proteins are also phosphorylated under various circumstances, yet the functional significance of their phosphorylation is unknown. My lab has previously reported that Vlk (vertebrate lonesome kinase) can act as a secreted protein tyrosine kinase. Although the phenotypes of Vlk knockout in mice has been reported to be associated with bone formation and lung organogenesis, the biological functions and significances of the Vlk kinase activity is largely unknown. I attempted to identify potential substrates of Vlk and to elucidate the function of tyrosine phosphorylation of these substrates by Vlk. In order to do so, I analyzed, by LC-MS/MS, tyrosine-phosphorylated proteins that are specifically enriched in wild type Vlk stably expressing K4 cells, human synoviocyte-like fibroblasts. I found four secreted proteins that are phosphorylated by Vlk: polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2 (GALNT2), osteopontin (OPN), atrial natriuretic peptide (ANP) and neuropeptide Y (NPY). Among these substrates, I selected NPY for further characterization. Here, I show that NPY is a phosphorylation target of Vlk, and that tyrosine phosphorylated NPY exhibits reduced bioactivity compared to non-phosphorylated NPY. NPY is widely distributed in human body, with higher concentrations in the central nervous system and the peripheral nervous system. NPY is involved in numerous physiological processes such as the regulation of food intake, blood pressure, emotion and etc. NPY signal is transduced intracellularly through NPY receptors (NPY1R, NPY2R, NPY4R and NPY5R) which belong to GPCR superfamily. In this study, I found evidences that Vlk phosphorylates NPY at Tyr49 residue. In addition, tyrosine phosphorylated NPY peptide exhibits significantly reduced receptor binding affinity when compared with non-phosphorylated NPY peptide. I also suggest several possibilities of Vlk associated function with other substrates.;단백질의 인산화는 세포 신호 전달 과정에 매우 중요하게 작용한다. 실제로 세포 내 단백질에 대한 연구는 매우 활발히 진행되었다. 그러나 세포 외 단백질의 티로신 인산화가 많이 일어남이 알려져 있음에도 불구하고, 이 단백질의 티로신 잔기 인산화가 생물학적으로 어떠한 기능을 하는지에 대하여 잘 알려져 있지 않다. 우리 실험실에서는 2014년에 분비되는 티로신 잔기 인산화 효소로, Vlk (vertebrate lonesome kinase)를 규명하였다. 이 Vlk를 발현하는 유전자에 문제가 생긴 쥐의 경우 대표적으로 뼈와 폐의 발생에 이상이 생기는 것이 알려져 있으나 그 과정에 인산화 효소로써의 기능이 관여하는지는 아직 밝혀져 있지 않다. 따라서 우리는 Vlk에 의한 세포 외 티로신 잔기의 인산화가 생체에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 Vlk의 기질을 찾아내었다. 이번 연구에서 나는 Neuropeptide Y (NPY)라는 Vlk의 기질을 규명하였고, Vlk가 이를 어떻게 조절하는지 연구를 진행했다. NPY는 중추 신경계와 말초 신경계에 분포하는 호르몬으로, 식욕, 혈압, 불안 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이 NPY에는 인간에서만 기능이 알려진 4개의 수용체가 존재하며 (NPY1R, NPY2R, NPY4R and NPY5R), 이들 수용체는 모두 GPCR에 속한다. 나는 PRESRO-TANGO라는 실험기법을 통하여 NPY와 티로신 인산화가 일어난 NPY의 수용체 친화성에 대한 실험을 진행하였고 그 결과, Vlk에 의한 NPY의 인산화는 NPY1R, NPY2R 그리고 NPY5R에 대한 수용체 친화성을 감소시킨다는 것을 규명하였다. 이것은 잠재적으로 Vlk가 NPY를 인산화 시킴으로써 NPY의 신호 전달을 저해 할 수 있다는 가능성을 나타내는 결과이다.