Liquid chromatography-mass spectrometry based metabolomics for differential alteration in non-obese and obese subjects with Non-alcoholic fatty liver disease

Abstract

Background and aims: Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common chronic liver disease that can affect both non-obese and obese individuals. The mechanism for development and progression of non-obese NAFLD remains unclear. Moreover, early and non-invasive diagnosis for progression of NAFLD is still a challenge. Therefore, lipid profiling and targeted approaches for bile acids and methionine metabolism were performed to find relevant non-invasive biomarkers associated with non-obese and obese NAFLD. Methods: Both lipid profiling and targeted metabolomic strategies were performed on 361 sera of subjects with biopsy-proven NAFLD and healthy controls. Subjects were divided by their body mass index (BMI) and NAFLD progression into non-obese (BMI <25 kg/m2, n = 130; No-NAFLD 48, NAFL 51, NASH 31) and obese (BMI ≥25 kg/m2, n = 231; No-NAFLD 18, NAFL 106, NASH 107) groups. Lipid profiling using UPLC/QTOF MS and targeted analysis based on UHPLC/TQ MS combining univariate and multivariate statistical analysis were performed to identify potential biomarkers which attribute to progression of NAFLD. Results: In lipid profiling, the most discriminating metabolites were identified as diacylglycerol (DAG) and triacylglycerol (TAG), and sphingomyelin (SM). Moreover, several SMs containing saturated acyl chain (d36:0, d38:0, d40:0) were distinctively altered by NAFLD severity across the non-obese and obese groups. In targeted analysis, bile acids had characteristic in the elution order; glycine conjugate, unconjugated and taurine conjugate of bile acid. Although the structures were very similar, the bile acids were well separated from one another and showed different concentrations in human serum as well as higher bile acid concentrations following NAFLD severity with some variations. In quantitative analysis of methionine metabolism, improvements compared to two columns, SM-C18 and HSS T3, were observed regarding to peak shape and separation. This analysis showed a similar trend in methionine pathway following NAFLD progression, regardless of obesity. Conclusion: Remarkable alterations of human serum metabolites were demonstrated across the histological spectrum of NAFLD between non-obese and obese subjects. Although bile acids and methionine metabolism showed similar alteration, determining the specific serum lipid concentrations, DAG, TAG, and saturated SMs, may be a useful tool for diagnosis between simple steatosis and NASH patients who should be performed a liver biopsy. These findings could yield additional insights into metabolomic application as non-invasive tool in NAFLD diagnosis and provide evidence of metabolic complications in NAFLD with or without obesity. ;비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 알코올 섭취 또는 지방간을 초래하는 다른 원인에 의한 간 질환 등이 없으면서 간 내 지방의 침착 소견을 보이는 질환으로 비알콜성 지방간 (NAFL)과 비알콜성 지방간염 (NASH), 간경변증 (Cirrhosis)을 포함한다. NAFLD는 비만이 주요 원인으로 알려져 있으나, 비만인 사람은 물론 마른 사람에게도 나타나는 질환이다. 하지만 대부분의 NAFLD 관련 연구는 비만을 대상으로 진행되었으며, 마른 사람에게 나타나는 NAFLD의 발병 및 진행에 대한 메커니즘, 그리고 비만인 NAFLD 환자와의 대사적 차이에 대해서는 잘 알려지지 않았다. 또한 현재까지 NAFLD에 대한 가장 명확한 진단 방법은 간 조직 검사로 NAFL과 NASH를 조기에 구별할 수 있는 비침습적 진단은 여전히 어려운 과제로 남아있다. 따라서 본 연구에서는 마른 사람과 비만인 사람에게 나타나는 NAFLD의 진행 단계별 대사적 차이를 확인하고, 이를 통한 비침습적인 진단 방법을 찾기 위해 대사체 프로파일링과 특정 대사를 타겟으로 한 정량 분석을 진행하였다. 생검을 통해 확인된 NAFLD 환자와 건강한 사람을 체질량 지수 (BMI)와 NAFLD의 진행 단계에 따라 비만이 아닌 그룹(BMI <25 kg/m2, n = 130; No-NAFLD 48, NAFL 51, NASH 31)과 비만인 그룹(BMI ≥25 kg/m2, n = 231; No-NAFLD 18, NAFL 106, NASH 107)으로 나누었다. 총 361개의 혈청에 대해 UPLC/QTOF MS를 이용한 지질 대사체 프로파일링과 UHPLC/TQ MS를 이용한 담즙산 및 메티오닌 대사에 대한 타겟 정량 분석을 단변량 및 다변량 통계 분석과 함께 진행하였다. 지질 대사체 프로파일링에서는 디아실글리세롤 (DAG)과 트리아시글리세롤(TAG), 그리고 스핑고마이엘린 (SM)이 비만이 아닌 그룹과 비만인 그룹에서 NAFLD의 진행 단계에 따라 유의적인 대사적 차이를 보여주었다. 특히 포화된 아실 체인(Saturated acyl chain)을 가지고 있는 SM (d36:0, d38:0, d40:0)의 경우, 비만이 아닌 그룹과 비만인 그룹 사이의 NAFLD 진행 단계별 대사적 차이가 가장 크게 나타나는 것을 확인하였다. 담즙산에 대한 타겟 정량 분석에서는 담즙산이 매우 유사한 구조를 가졌음에도 불구하고 컬럼을 통해 글리신 결합 (Glycine conjugate), 비결합, 타우린 결합 (Taurine conjugate) 담즙산의 순서로 잘 분리되는 것을 확인하였다. 사람의 혈청에서 서로 다른 담즙산의 농도를 확인하였고, 비만의 여부와 상관없이 NAFLD의 진행 단계에 따라 대부분의 담즙산의 농도가 증가하는 경향성을 보이는 것을 확인하였다. 메티오닌 대사를 타겟으로 한 정량 분석에서는 SM-C18 컬럼과 HSS T3 컬럼을 비교하여 분석하였고, HSS T3 컬럼이 대사 물질의 분리에 있어 더 나은 피크 모양을 보여주는 것을 확인하였다. 메티오닌 대사의 경우, 비만의 여부와 상관없이 NAFLD의 진행 단계에 따라 유사한 대사적 변화를 보여주었다. 본 연구에서는 BMI 25를 기준으로 비만이 아닌 사람과 비만인 사람에게 나타나는 NAFLD의 진행 단계별 대사적 차이를 확인하였다. 담즙산과 메티오닌 대사에서는 비만의 여부와 상관없이 NAFLD의 진행 단계에 따라 유사한 대사적 변화를 보여주었지만, 특정 혈청 지질 대사체의 농도, 즉 DAG와 TAG, 그리고 포화된 아실 체인을 가지는 SM (Dihydro sphingomyelin)의 경우, 비만의 여부와 NAFLD의 진행 단계에 따라 유의적인 대사적 차이를 보여주었다. 이러한 결과는 마른 사람에게 나타나는 비알콜성 지방간 질환의 발병 원인 및 진행에 대한 메커니즘 연구에 많은 기여를 할 것으로 예상된다. 나아가 메타볼로믹스 (Metabolomics)를 바탕으로 한 이러한 연구 결과는 BMI에 따른 NAFLD의 차별적인 치료적 접근 방법과 NAFL과 NASH를 구별할 수 있는 비침습적 진단 방법으로 활용될 수 있을 것이다.