Topological analysis of L-malate/succinate antiporter DcuE

Abstract

The rumen bacteria Actinobacillus succinogenes is natural succinate producer. The bacteria have several potential transport proteins related to succinate production. Major transporter is the L-malate/succinate antiport transporter (DcuE) that belongs to Dcu family. In this study, determination of DcuE membrane topology was performed. For experimental analysis, LacZ/PhoA colorimetric reporter gene assay known as classic membrane topology experiment was performed. LacZ has an activity in cytoplasmic side and PhoA in periplasmic side. To perform this assay, reporter gene(LacZ or PhoA) fusion proteins with truncated DcuE was produced. And then orientations of amino acids were determined using β-galactosidase and alkaline phosphatase colorimetric assays. To complement above data, western blotting analysis with anti-β-galactosidase and anti-alkaline phosphatase antibody was performed. The blot data shows the expression of each fusion protein. Finally, for confirming the membrane topology model, in silico modeling programs like TMHMM, CCTOP, PSIPRED and predictprotein were used. Using experimental and in silico analysis, DcuE topology model was determined. DcuE is expected to have 16 transmembranes, 9 cytoplasmic loops and 8 periplasmic loops. And amino-terminus of this protein starts at cytoplasmic side and carboxyl-terminus of this protein also ends at same side.;반추위세균인 Actinobacillus succinogenes는 발효에 의해 바이오숙신산을 대량생산하는 균주로 알려져 있다. 이 세균은 숙신산 생산과 관련된 다양한 수송체를 가지고 있는데, 그 중에서도 높은 발현양을 보이는 L-말산/숙신산 역수송체인 DcuE에 주목하였다. 막 관통 부위가 많은 막단백질의 특성 상 단백질 결정을 통한 구조 분석이 어려웠다. 따라서 본 연구에서는 실험적 기법과 in silico 데이터베이스를 병행하여 DcuE의 막위상을 결정하였다. 실험적 분석을 위해 먼저 DcuE의 일부분에 리포터 단백질인 β-galactosidase 혹은 alkaline phosphatase를 퓨전한 플라스미드를 제작하였다. 퓨전 단백질을 이용하여 막 위상에 따른 리포터 단백질의 활성도의 차이를 측정하였다. 활성값 비교를 통해 DcuE의 26개 아미노산 위치의 막 위상을 결정하였다. 퓨전 단백질은 웨스턴블롯을 통해 발현을 검증하였다. 실험 결과를 보완하고 단백질 2차 구조를 확인하기 위해 in silico 분석 또한 진행하였다. 막단백질 예측 프로그램인 TMHMM, predictprotein, DAS, CCTOP과 단백질 2차 구조 예측 프로그램인 Jpred, PSIPRED를 사용하였다. DcuE의 막 위상 모델을 완성하였으며, DcuE는 16개의 막관통부위를 가지고 있으며, N말단과 C말단 모두 세포질에 위치함을 밝혔다.