Comprehensive mechanistic studies of a tetraspanin arginine sensor, polypharmacological profiling of montelukast, and in silico design of elongation factor 1-alpha inhibitors

Abstract

Part III. In silico design and optimization of nannocystin A against eukaryotic elongation factor 1-alpha Eukaryotic elongation factor 1-alpha (eEF1A) primarily delivers aminoacylated-tRNA (aa-tRNA) to the ribosome A-site, but is also involved in actin cytoskeleton regulation, ubiquitin-mediated proteolysis, and apoptosis. eEF1A has been implicated in cancer but the detailed mechanism of its involvement remains unclear. Nonetheless, eEF1A garnered interest as a novel target for anticancer drug discovery. Nannocystin A and its analogs possess potent cytotoxic activity against several human cancer cell lines. This cytotoxic activity is postulated to be due to the inhibition of the eEF1A complex. Docking and in silico cell permeability prediction was performed to analyze their structure-activity relationship (SAR). Modification of the nannocystin chemotype led to distinct changes in the predicted cell permeabilities and binding activities. Findings from these studies suggest that coordinated lead optimization is needed to avoid cases where improving one property is detrimental to other compound properties, and instead concurrently improve both potency and pharmacokinetic properties. Better understanding of the SAR for this natural product and its analogs is beneficial for lead optimization and design of novel inhibitors against eEF1A for the treatment of cancer.;Part I. Comprehensive mechanistic studies for the structural and functional elucidation of transmembrane 4 L6 family member 5 Transmembrane 4 L six family 5 (TM4SF5)는 다른 TM4SF, 성장 인자 수용체, 신호 전달 단백질 및 인테그린 등과 상호 작용하는 세포막 투과성 단백질로, 제어 불가능한 세포 성장과 증식을 일으켜 섬유화와 암을 유발한다. TM4SF5는 진정한 tetraspanin 과 유사하게 4개의 transmembrane (TM) helices, short extracellular loop (SEL)과 long extracellular loop (LEL)을 포함하는 2개의 extracellular loop, 1개의 intracellular loop, 그리고 N- 및 C-terminal cytoplasmic tail로 구성되어있다. TM4SF5의 LEL 부분은 단백질의 기능 및 molecular partner와의 상호 작용에 필수적이다. TM4SF5는 mTORC1 활성화를 위한 arginine sensor로도 작동한다. LEL 부분의 보존된 잔기에 돌연변이가 일어날 경우, mTORC1 기능에 중요한 영향을 미치는 것을 통해 TM4SF5가 해당 신호전달 경로에 관여한다는 것이 밝혀졌다. TM4SF5의 중요한 구조적 특징을 조사하기 위해, CD81을 template으로 사용하여 homology modeling을 수행했다. TM4SF5의 LEL 부분에서의 L-arginine과 4'-(p-toluenesulfonylamido)-4-hydroxychalcone (TSAHC)의 결합 모드를 예측하기 위해 분자 도킹을 수행하였고, L-arginine 결합에 W124와 Y126이 중요하게 작용한다는 것을 알 수 있었다. 이는 돌연변이 연구 결과와도 일치한 결과이다. 이어서, W124와 Y126의 wild type 및 돌연변이(W124A 및 Y126S) 구조에 대해 molecular dynamics (MD) 시뮬레이션을 수행했다. 그 결과, W124이 TM4SF5의 구조적 완전성과 단백질 에너지 네트워크에서의 중요성을 보여주었다.;Part II. Big data analysis of montelukast use related with neuropsychiatric events and off-target validation Montelukast (Singulair®, Merck & Co, Inc, USA) is a potent cysteinyl leukotriene receptor subtype 1 (CysLTR1) antagonist used to treat asthma and allergic rhinitis. Its association with neuropsychiatric adverse effects remains controversial due to opposing results in clinical trials and post-marketing reports. The association between montelukast and suicidality and other psychiatric behaviors was investigated using population-scale retrospective statistical analysis of the FDA Adverse Event Reporting System (FAERS) database. Calculation of odds ratios (ORs) with 95% Confidence Interval (CI) showed that montelukast was positively associated with suicidality and its known risk factors, as compared to other asthma drugs. Removing the potential bias of the 2008 FDA warning for montelukast showed that montelukast was, nevertheless, correlated with suicidal ideation and its other risk factors. Males had higher ORs for suicidality, psychiatric, and sleep problems, whereas females had higher ORs for allergy. Those aged below 18 had the highest ORs for neuropsychiatric and sleep problems. In this cluster, suicidality was attributed to those aged over 10, while, surprisingly, those below 10 years old showed high ORs for homicidal ideation, which has not been noted before. Moreover, montelukast was found to have a weak 5-HT2B receptor (5-HTR2B) antagonistic activity, which is a mechanism related to psychiatric and impulsive behaviors.;Part II. Big data analysis of montelukast use related with neuropsychiatric events and off-target validation Montelukast (Singulair®, Merck & Co, Inc, USA)는 잘 알려진 leukotriene modifying agent (LTMA)이자 cysteinyl leukotriene receptor subtype 1 (CysLT1) 길항제로서 천식 및 알레르기성 비염 치료제이다. 신경정신과적 부작용에 대한 임상시험 결과와 시판 후 보고 간의 상반된 결론 때문에 지금도 의견이 분분하다. 이를 분석하고자 FDA Adverse Event Reporting System (FAERS) database를 기반으로 인구 규모의 후향적 통계 분석을 통해 montelukast와 자살을 비롯한 다른 신경정신과적 부작용 사이의 연관성에 대한 조사를 수행하였다. 95 % 신뢰구간(Confidence Interval, CI)으로 odds ratio (OR)를 계산한 결과, 다른 천식 약물에 비해 montelukast는 자살률을 비롯한 기존에 알려진 위험 인자와 상관관계가 있음이 나타났다. 2008년에 있었던 Montelukast에 대한 FDA의 경고에서 비롯될 수 있는 잠재적 편향을 제거했음에도, 여전히 montelukast와 자살기도 및 기타 위험 요인 간에 상관관계가 있음을 보여주었다. 남성은 자살 충동, 정신병 및 수면 장애에 대한 OR이 더 높았으며 여성은 알레르기에 대한 OR이 더 높았다. 18 세 이하 청소년에서 신경정신과적 부작용과 수면 장애에 대한 OR이 가장 높았다. 이 집단을 나눠서 분석한 결과 10세 이상에서는 자살충동이 특징적으로 나타났으며, 한편으로는 10세 이하에서는 살인충동에 대한 높은 OR를 보인다는 놀랍고도 새로운 발견이 나타났다. 또한, montelukast는 정신병적 및 충동적 행동과 관련된 메커니즘으로 5-HT2B 수용체 (5-HTR2B)에 대해 약한 길항 작용을 갖는 것으로 밝혀졌다.;Part III. In silico design and optimization of nannocystin A against eukaryotic elongation factor 1-alpha. Eukaryotic elongation factor 1-alpha (eEF1A)는 주로 aminoacylated-tRNA (aa-tRNA)를 리보솜의 A 사이트에 전달하며, 그 외에도 actin cytoskeleton의 조절과 유비퀴틴 매개 단백질 분해 및 세포사멸에도 관여한다. eEF1A는 암과 연관된 단백질로 알려져 있으며, 그 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 이러한 사유로 eEF1A는 항암제 개발을 위한 새로운 타겟 단백질로서 연구자들의 관심을 받고 있다. Nannocystin A와 그 유도체들은 다양한 인간 암 세포주에 대해 강력한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 Nannocystin의 세포 독성 활성이 eEF1A 복합체에 대한 억제에서 비롯되었다는 가설이 기존 선행연구로부터 수립되어 있다. 구조-활성 관계(Structure-Activity Relationship, SAR)를 분석하기 위해 분자도킹과 in silico 세포 투과성 예측에 대한 연구를 수행하였다. Nannocystin chemotype의 변형은 세포 투과성 및 결합 활성 예측 결과에 뚜렷한 변화를 가져왔다. 이러한 결과들은 하나의 특성을 제고하기 위해 다른 화합물들의 특성에 영향을 주는 것을 방지해야 하기 때문에 약효와 약물동태학적 특성을 동시에 개선하는 통합적인 선도물질 최적화가 필요하다는 것을 제시하였다. Nannocystin A와 그 유도체의 SAR에 대한 이해는 항암 치료를 위한 새로운 eEF1A 저해제의 설계와 선도물질 최적화에 도움이 될 것으로 사료된다.;Part I. Comprehensive mechanistic studies for the structural and functional elucidation of transmembrane 4 L6 family member 5 Transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5) is a transmembrane protein that interacts with other TM4SFs, growth factor receptors, signaling proteins, and integrins, leading to uncontrollable cell growth and proliferation and resulting in fibrosis and cancer. Like genuine tetraspanins, TM4SF5 has 4 transmembrane (TM) helices, short (SEL) and long extracellular loops (LEL), an intracellular loop (ICL), and N- and C-terminal cytosolic tails. The LEL region of TM4SF5 is integral to its function and interactions with its molecular partners. TM4SF5 also works as an arginine sensor for mTORC1 activation. Mutations of conserved residues in the LEL region were found to significantly affect mTORC1 function supporting the involvement of TM4SF5 in this pathway. To investigate important structural features of TM4SF5, homology modeling was done with CD81 (a genuine tetraspanin) as template. Docking was implemented to predict binding modes of L-arginine and TSAHC in the TM4SF5LEL. W124 and Y126 were notably important for L-arginine binding. Subsequently, molecular dynamics (MD) simulations were implemented for the wild type and mutant (W124A and Y126S) structures. Trajectory and network analyses revealed the importance of W124 to the structure and protein energy network of TM4SF5.