Pharmacological Rescue of Defective Mitophagy in PINK1 Deficiency

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a common progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by the selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN). Symptomatic treatments in PD are effective in the early stages of the disease; however, as PD progresses and more nigral dopamine neurons die, most patients develop motor complications. Unfortunately, there is no known neuroprotective therapy that can slow or halt disease progression. Elucidation of the possible pathogenic mechanisms underlying dopamine cell death have significantly expanded in recent years. Although the exact pathogenic mechanism remain unknown, mitochondrial dysfunction has been suggested as one of major underlying causes of PD. Gene mutations in the familial PD-associated proteins, such as α-synuclein, leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), Parkin, and DJ-1, are involved in mitochondrial impairments in cellular and animal models of PD as well as in PD patients. The failures that trigger mitophagy, which is implicated in the pathogenesis of some familial PD, can be caused by mutations in PINK1 or Parkin. According to the prevailing PINK1-Parkin signaling model, mitophagy is promoted by the mitochondrial translocation of Parkin, an essential PINK1-dependent step that occurs via a previously unknown mechanism. Here, I demonstrate that critical concentrations of nitric oxide (NO) are sufficient to induce the mitochondrial translocation of Parkin even in the setting of PINK1 deficiency, with apparent increased interaction of accumulated full-length PINK1 and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) during the process of mitophagy. Specifically, a specific range of NO (20 nM ~ 10 M) enabled PINK1-null dopaminergic neuronal cells to regain Parkin mitochondrial translocation, which was significantly suppressed by an nNOS-null mutation. Moreover, the nNOS-null mutation resulted in the same mitochondrial electron transport chain (ETC) enzyme deficits as PINK1-null mutation did. The involvement of mitochondrial nNOS activation in mitophagy was further confirmed by the observation of greatly increased interactions between full-length PINK1 with nNOS that were accompanied by mitochondrial accumulation of phospho-nNOS (Ser1412) during mitophagy. Notably, an L347P PINK1 mutant failed to bind to nNOS. The loss of nNOS phosphorylation and Parkin accumulation in PINK1-deficient mitochondria could be reversed in a PINK1-dependent manner. Finally, nontoxic levels of NO treatment allowed PINK1-null dopaminergic neuronal cells to recover from mitochondrial ETC enzyme deficits. In summary, I demonstrate that accumulation full-length PINK1 is required for nNOS recruitment during mitophagy and is involved in inducing Parkin translocation and discuss the feasibility of NO-based pharmacotherapy to address defective mitophagy and ETC enzyme deficits in certain familial forms of PD.;파킨슨병은 운동기능 이상을 수반하는 대표적인 퇴행성 뇌 질환으로서 평균 수명이 길어짐에 따라 환자수가 크게 늘어나고 있다. 하지만 치료법이 단기적 증상 호전 치료의 수준에 머물고 있어 병의 진행을 막지는 못하고 있는 실정이며, 그 병인기전 또한 명확이 알려져 있지 않아 약물학적 치료를 위한 새로운 타켓의 발굴이 절실히 요구되고 있다. 유전성 파킨슨병의 원인 단백질 (PINK1, Parkin, DJ-1, LRRK2, a-synuclein 등) 변이의 결과로 미토콘드리아의 구조적, 기능적 이상이 확인 되면서 미토콘드리아 이상이 파킨슨병의 주요한 병인기전으로 고려되고 있다. 따라서 본 연구실에서는 PINK1 결손 도파민 신경세포를 개발하여 미토콘드리아의 내막 구조 손상과 complex (I, II, IV) 기능 활성 저하 현상을 앞서 보고한 바 있다. 또한 본 모델은 미토파지 장애도 수반함을 실험적으로 증명하였다. 손상된 미토콘드리아를 분해함으로써 세포 항상성에 기여하는 과정을 미토파지라 일컫는데, 미토파지의 이상이 PINK1, Parkin 유전변이로 인한 유전성 파킨슨병의 한 기전으로 고려되고 있다. 최근에 대두되고 있는 PINK1-Parkin 모델에 따르면, Parkin의 미토콘드리아로의 이동이 미토파지 유도의 결정적 과정이며 이는 PINK1에 의해 유발된다는 것이 잘 알려져 있다. 하지만, PINK1에 의한 Parkin 이동 과정의 구체적인 기전은 명확하게 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 기존에 알려져 있지 않은, 저 농도의 일산화 질소(NO)가 PINK1 결손 상황에서 미토콘드리아로의 Parkin 이동을 유도하는 현상을 보고하고 있다. 또한, 미토파지 과정에서 일어나는 Parkin의 이동이, 신경 세포 내에서 일산화 질소를 발생시키는 효소인 nNOS를 결손 시킨 mouse embryonic fibroblast (MEF)에서, 대조군에 비하여 현저히 저하되어 있음을 확인하였다. 이는 선택적 저해제를 가하여 유도한 약물학적 nNOS 기능 저하 상황에서도 반복되는 결과였다. 특히 CCCP를 사용한 미토파지 유도는, 통상 wild type인 SN4741 cell에서 효과적으로 유도되나, 이러한 과정은 PINK1 손상 도파민 세포에서는 일어나지 않는데, 이것을 일산화 질소 처리로써 회복시킬 수 있었다. 또한 미토파지 과정에서 증가하는 full length-PINK1이 nNOS와 결합하며, 반면 PINK1 kinase 활성이 감소되어 있는 PINK1 돌연변이 (PINK1 L347P)의 경우 그 결합력이 크게 감소하는 것을 확인하였다. nNOS의 경우 인산화(Ser1412)가 되면 그 활성이 증가하여 일산화 질소를 발생시키는데, CCCP에 의한 미토파지 유도시, nNOS 인산화 형태인 phospho-nNOS (Ser 1412)가 증가하며 이 때 미토콘드리아내 nNOS 축적이 관찰되었다. 이러한 과정은 PINK1 손상 도파민 세포에서는 현저히 저하되어 있었고, PINK1을 과발현 시키자 CCCP에 의한 phospho-nNOS (Ser 1412)의 증가가 다시 원활히 이루어 졌다. 하지만 PINK1 L347P mutant의 과발현은 CCCP에 의한 phospho-nNOS (Ser 1412)의 증가를 유도시키지 못했다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때, PINK1과 nNOS 관련 산화 질소 신호 전달 체계는 미토파지 과정에서 밀접하게 연계하여 미토콘드리아로의 Parkin 이동을 유도하고 결과적으로 미토콘드리아 분해를 가능하게 함을 알 수 있었다. 일산화 질소의 증가가 세포 내의 cGMP 농도를 높이는 것이 알려져 있는데, cGMP analogue와 cGMP의 분해를 저해하여 농도를 높이는 PDE5 저해제인 sildenafil 처리시, 두 경우 모두 미토콘드리아로의 Parkin 이동 현상을 유도하였다. 이로써 미토파지에서의 nNOS 하위 작용 기전으로서 cGMP가 관여함을 추정하였다. 앞서 밝힌 PINK1 결손 세포에서의 미토콘드리아 기능 저하가 nNOS 결손 MEF 세포에서도 마찬가지로 관찰되었다. Wild type 도파민 신경 세포 SN4741에 nNOS 선택적 저해제 (NAAN)를 처리하였을 때 역시, 미토콘드리아의 complex (I, II, IV) 활성이 떨어진 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 통해 PINK1 결손 세포에서의 미토콘드리아 기능 저하의 원인 중 하나로서 산화 질소 연계 signaling 과정의 기능 저하로 보고 일산화 질소 공여체를 처리한 결과 미토콘드리아 complex (I, II, IV) 활성이 크게 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 미토파지 상황에서의 full length-PINK1과 nNOS의 결합, PINK1에 의존적인 nNOS 활성화를 보이고, 미토콘드리아로의 Parkin 이동에서 nNOS가 주요한 역할을 함을 밝히고 있다. 또한 유전적 PINK1 결손 도파민 신경세포에서 저농도의 일산화 질소가 Parkin 이동, 미토콘드리아 분해, 미토콘드리아 전자 전달계 효소 기능 회복의 약물학적 유도를 확인함으로써, 유전성 파킨슨 병에서의 미토파지 이상, 미토콘드리아의 전자 전달계 효소 기능 저하의 회복을 유도할 수 있는 새로운 치료 후보 물질로 일산화 질소 공여체를 제시하는 바이다.