Crystal structure of D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase from Yersinia pseudotuberculosis

Abstract

The Gram-negative bacterium Yersinia pseudotuberculosis is the causative agent of yersiniosis. D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase (HddC) is the fourth enzyme of the GDP-D-glycero-α-D-manno-heptose biosynthesis pathway which is important for the virulence of the microorganism. Therefore, HddC is a potential target of antibiotics against yersiniosis. In this study, HddC from the synthesized HddC gene of Y. pseudotuberculosis has been expressed, purified, crystallized. Synchrotron X-ray data from a selenomethionine-substituted HddC crystal were also collected and its structure was determined at 2.0 Å resolution. Structure analyses revealed that it belongs to the glycosyltransferase A type superfamily members with the signature motif GXGXR for nucleotide binding. Despite of remarkable structural similarity, HddC uses GTP for catalysis instead of CTP and UTP which are used for other major family members, cytidylyltransferase and uridylyltransferase, respectively. We suggest that EXXPLGTGGA and L(S/A/G)X(S/G) motifs are probably essential to bind with GTP and a FSFE motif with substrate.;가성결핵균 (Yersinia pseudotuberculosis) 은 예르시니아증 (yersiniosis) 의 원인균이다. 가성결핵균의 HddC 단백질 (D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase from Y. pseudotuberculosis, YpHddC) 은 GDP-D-glycero-α-D-manno-heptose biosynthesis pathway 의 4번째 효소에 해당하며, 이것은 미생물이 병독성을 나타내는데 중요한 역할을 한다. 따라서 HddC 단백질은 예르시니아증의 항생제 개발에 타겟으로 쓰일 수 있는 중요한 단백질이다. 본 연구에서는 가성결핵균의 HddC 유전자를 합성하여 발현시키고, 분리·정제하고 결정을 얻었다. 결정을 얻기 위해 먼저 Dynamic Light Scattering (DLS) 의 결과를 통해 YpHddC 단백질의 동질성 (the homogeneity of the protein) 을 확보할 수 있는 버퍼의 조건인 20mM HEPES pH 7.5 로 단백질의 버퍼를 교체하였다. 결정은 단백질의 농도, 12 mg/ml 와 버퍼의 조건, 0.1 M HEPES pH 7.0, 2.2 M ammonium sulfate 에서 얻었다. 포항가속기 연구소의 방사광을 이용하여 YpHddC 단백질의 synchroton X-ray data 를 얻었고 X-선 결정구조를 규명하였다. YpHddC는 뉴클레오티딜전이효소 중 하나로, GTP 로부터 GMP 부분을 기질인 D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate 에 전달한다. YpHddC 의 구조는 glycosyltransferase A type superfamily 의 구조적 특징 중 하나인 결합부위의 로스만 유사구조(Rossmann-like fold)를 가지며, 동종 단백질(homologous protein) 간에 보존되어 있는 GXGXR 서열 모티프를 가지고 있다. Dali server 를 통해 YpHddC 단백질과 구조적인 유사성이 높은 단백질 구조를 여러 개 선정하여 비교해보았다. 주목할 만한 점은 YpHddC 단백질은 cytidylyltransferase 와 uridylyltransferase 단백질과 구조적인 유사성이 상당히 높음에도 불구하고 뉴클레오티드를 기질에 전달할 때 CTP 나 UTP 를 사용하는 것이 아니라 GTP를 사용한다. 본 연구에서는 YpHddC 단백질과 glycosyltransferase A type superfamily 에 속하는 단백질들 간의 서열의 동등성과 구조적인 유사성을 비교하여 분석하였으며 YpHddC 단백질이 GTP와 결합하기 위해서 EXXPLGTGGA 와 L(S/A/G)X(S/G) 모티프가 필수적이며 기질과 결합하기 위해서는 FSFE 모티프가 필수적이라고 제안한다.