Ca2+-mediated Translocation of m-Calpain Induces Ku80 Cleavage and Enhances Ku80-related DNA Repair Pathway

Abstract

Calpains, a family of cysteine protease, are activated through calcium ion influx. Among the 15 isoforms, most well-known isoforms are calpain 1 (μ-calpain) and calpain 2 (m-calpain) which require micromolar and milimolar concentration of calcium for their full activation in vitro, respectively. The proteolytic activity of calpains regulates many cellular pathways through cleavage of diverse substrate proteins. μ-Calpain is reported to be essential for normal neuronal function, whereas m-calpain is more related to proliferation of cancer cells. Despite the well-categorized functions of each calpain isoform, it is still necessary to clarify the isomer-specificity of calpains in cellular activities. Recent studies have reported that m-calpain tranlocates from the cytosol to the nucleus but its effect is mostly unknown. Therefore, we have been trying to discover nuclear proteins that can be directly regulated by translocated m-calpain through proteomic analysis. Proteomic analysis of ionomycin-treated and untreated mammary epithelial MCF10A cells clarified differences in Ku80 cleavage. Ku80 is a subunit of Ku protein complex, known as an initiator of non-homologous end joining (NHEJ) double-strand breaks (DSBs) repair pathway. When DNA DSBs occur, Ku70/80 heterodimer is formed and recruited to DNA DSBs end which leads to initiation of NHEJ repair pathway. In this study, nuclear Ku80 was cleaved in calcium dependent manner. We also confirmed through immunoprecipitation, immunofluorescence, western blotting in m-calpain knock-down cells and cell-free in vitro assay that only m-calpain cleaved α/β domain of Ku80. Also cleaved Ku80 still formed Ku heterodimer and promoted DNA DSBs repair activity. Taken together, it becomes clear that translocated m-calpain has direct effects on NHEJ pathway through cleavage of Ku80. Based on this study, the mechanism of m-calpain on DNA repair pathways can be a new anti-cancer drug target.;Calpain은 인체 내에서 칼슘에 의해 활성화되는 cysteine protease이다. 15개의 이성체가 존재하고 있으며, 가장 잘 알려진 것은 인체 어디에서나 존재하는 calpain 1과 calpain 2이다. 이 것은 생체 외에서 활성화되기 위해 각각 micromolar와 milimolar 정도의 칼슘을 필요로 하기 때문에 μ-calpain과 m-calpain이라 불리기도 한다. Calpain은 세포 내에 존재하는 기질 단백질을 절단함으로써 전사, 세포의 구조 유지, 세포 사멸 등에 관여한다. 특히 μ-calpain은 신경 세포의 기능에 필수적이라고 알려져 있어 현재 알츠하이머 질병 치료제로서 연구가 많이 진행되고 있다. 한편 m-calpain은 암세포의 증식, 전이 등과의 연관성이 알려지면서 항암제로서의 개발 가능성이 활발하게 제시되고 있다. 하지만 calpain의 모든 기질 단백질이 아직 밝혀지지 않았고, 특히 이성제에 따른 역할이 명확하게 규명되지 않았기 때문에 지속적으로 연구가 필요하다고 할 수 있다. 최근 연구에 따르면 세포질에 존재하는 m-calpain가 활성화되면서 핵으로 이동하는 것으로 알려졌다. 하지만 핵에서의 기질 단백질에 대해 자세히 연구된 바가 없으므로 우리는 핵으로 이동한 m-calpain가 어떤 단백질을 자르는지 확인하기 위하여 ionomycin 처리를 통해 칼슘 농도 증가를 유도한 후, 핵 단백질만을 이용하여 단백체 분석을 진행하였다. 그 결과 정상 유방 상피세포인 MCF10A에서 칼슘 유입이 증가되었을 때 Erk kinase가 유의성있게 변화하는 것이 확인되었다. Erk kinase는 DNA 이중 가닥 절단을 수선하는 경로인 non-homologous end joining (NHEJ) 경로의 활성화에 관여하는 단백질로 알려져 있다. NHEJ 경로는 또 다른 DNA 이중 가닥 절단 수선 경로인 homologous recombination (HR)과 달리 상동 관계에 구애 받지 않는 것으로, HR이 상동 염색체가 필요하기 때문에 세포 주기 중 G2와 S 기에서만 일어나는 것과 달리 NHEJ는 모든 세포 주기에서 활발하게 일어난다. Ku 단백질은 Ku70과 Ku80의 이중이합체로 존재하며, DNA의 이중 결합이 손상되면 손상 부위에 부착하여 NHEJ 경로를 시작한다. 본 연구는 단백체 분석을 통하여 Erk kinase가 유의성 있게 변화한다는 결과를 바탕으로 칼슘 농도의 증가가 DNA 이중 가닥 절단 수선 경로의 활성화에 영향을 줄 것이라고 추측하였다. 또한 NHEJ의 개시인자라고 할 수 있는 Ku 단백질이 산화적 스트레스에 의해 핵에서의 발현이 쉽게 변화하고, Ku80이 단백질 분해 효소에 민감하게 반응한다는 선행 연구를 바탕으로 Ku 단백질의 발현이 변화함으로써 NHEJ의 활성이 변화할 것이라고 예상하였다. Ionomycin처리에 의한 칼슘 유입을 유도한 후 웨스턴블럿을 수행한 결과 Ku70은 세포질과 핵에서 아무런 변화가 없었으나, Ku80은 세포질에서와 달리 핵에서 칼슘 농도 유입이 증가함에 따라 잘린 형태가 나타나는 것을 확인하였다. 또한 면역 형광법을 이용하여 m-calpain가 활성화됨으로써 핵 안으로 이동하는 것을 확인하였으며, calpan 억제제인 calpeptin을 처리하였을 때 Ku80의 잘린 형태가 감소하는 것을 통하여 calpain이 Ku80을 자르는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 밖에서 정제된 단백질만을 이용하여 분석한 결과 Ku70은 μ-calpain과 m-calpain이 활성화되었을 때 아무런 변화가 없었고 Ku80도 μ-calpain에 의해서 아무런 변화가 없었으나, m-calpain에 의해서는 완벽하게 잘리는 것을 확인함으로써 Ku80이 m-calpain에 의해서만 잘리는 기질 단백질임을 보았다. 이는 shRNA을 처리하여 m-calpain의 발현을 감소시킨 후 칼슘 농도를 증가시켰을 때 세포 안에서 잘린 형태의 Ku80이 생성되지 않았음을 확인함으로써 다시 한 번 입증하였다. Ku80의 아미노 말단과 카르복시 말단을 각각 293FT 세포에 주입하여 칼슘농도를 증가시킨 결과 아미노 말단의 Ku80이 감지되지 않는 것을 통해 Ku80의 α/β 영역에서 m-calpain에 의한 절단이 일어나는 것을 알 수 있었다. 또 잘려진 Ku80의 기능을 확인하기 위해 면역 침강법을 진행한 결과 m-calpain에 의해 잘려진 Ku80이 여전히 Ku70과 이중이합체를 형성하였다. 더불어 DNA 손상 지표로 널리 사용되고 있는 γ-H2AX의 발현과 혜성 분석을 통하여 DNA 손상과 수선에 잘려진 Ku80의 영향을 확인한 결과, ionomycin 처리에 의해 유도된 Ku80의 절단은 adriamycin에 의해 손상된 DNA의 수선을 더 활발하게 하였고, calpain 억제제를 처리하였을 때 DNA 손상이 복구되지 못하는 것을 확인하였다. DNA 손상과 수선은 종양 형성과 항암 작용에 깊은 관련성이 있으므로 본 연구는 calpain 억제제가 DNA 수선 활성을 저해함으로써 발암을 억제하고 항암 효과를 나타내는 새로운 항암 요법으로 개발될 수 있는 가능성을 제시하였다.