Characterization of the Biosynthetic Pathways for Gentamicin

Abstract

Since the discovery of the first aminoglycoside antibiotic streptomycin, tremendous research of antibiotic from Actinomycetes has marked an epoch in the antibiotic market. However, indiscriminate use of antibiotic has led the antibiotic resistance, which is one of the biggest threats to global health. The discovery of novel aminoglycoside through structural modification provides a potential way to overcome the antibiotic resistance. Elucidation and engineering of aminoglycoside biosynthetic pathway can be an alternative strategy for developing aminoglycoside structural diversity. In this study, we focused on the gentamicin biosynthetic pathway. Gentamicin is an aminoglycoside antibiotic generally used to treat serious Gram-negative bacterial infection. Among gentamicin biosynthetic pathway, we aimed to identify amination and deamination steps at C6′ and C2′ positions of gentamicin, which is the target moieties of aminoglycoside modification for antibiotic resistance. Chapter I gave a brief overview of the overall characteristics of aminoglycoside antibiotics and previous studies on aminoglycoside biosynthetic pathways. The Materials and Methods section of Chapter II provided a technical information on the identification of gentamicin biosynthetic pathway. In Chapter III, C6′-amination of gentamicin biosynthesis was characterized by in vitro reconstitution. The dehydrogenase GenQ and the aminotransferase GenB1 were involved in catalyzing the amination at C6′ of possible substrates from gentamicin intermediates. GenQ-B1 showed a narrow substrate specificity between the substrates and this result had confirmed the low productivity of gentamicin B in wild-type Micromonospora echinospora. In addition, solving the crystal structure of the aminotransferase GenB1 explained its substrate specificity. In Chapter IV, the detailed biosynthetic pathway to C2′-deamination was characterized based on in vitro reconstitution with the dioxygenase GenJ, the reductase GenK2, and available substrates. Although GenJ and GenK2 was located on different region from the previously characterized gentamicin biosynthetic gene cluster, they represented high in vitro C2′-deamination activity against JI-20A which is the key intermediate toward gentamicin B biosynthesis. To support the reason for poor productivity of Gentamicin B in wild-type strain, transcriptional analysis was carried out by semi-quantitative RT-PCR. Comparing the transcriptional level between GenJ-K2 and other gentamicin biosynthetic genes, GenJ-K2 revealed lower expression than others. This results fully accounted for the insufficient production of gentamicin B in wild-type M.echinospora. In summary, we identified the C6′-amination and C2′-deamination in the assembly of gentamicin B. These studies could provide a useful information to develop new aminoglycoside derivatives by pathway reengineering.;아미노글라이코사이드 계열의 항생제인 스트렙토마이신 (streptomycin)이 처음 발견된 이래로 방선균 유래 항생제에 대한 깊이 있는 연구가 항생제 시장에 획기적인 발전을 가져왔다. 하지만 무분별한 항생제의 사용으로 항생제의 내성이 생기기 시작했고, 이는 세계 보건의 가장 큰 위협 중 하나가 되었다. 이를 극복하기 위한 방법 중 하나로 구조적 변형을 통한 신규 아미노글라이코사이드(aminoglycoside)를 개발하는 것이 있는데 아미노글라이코사이드의 생합성 경로를 규명하는 것은 아미노글라이코사이드의 구조 변형을 위한 잠재적 전략이 될 수 있다. 아미노글라이코사이드 계열의 항생제 중 젠타마이신 (gentamicin)은 심각한 그램 음성 박테리아 감염을 치료하는데 쓰이는 항생제이다. Gentamicin을 생산하는 균주인 마이크로모노스포라 에키노스포라 (Micromonospora echinospora)에서 소량 생산되는 물질인 젠타마이신 비 (gentamicin B)에서 탄소 1번 아민 그룹에 (S)-3-아미노-2-하이드록시프로피오닐 ((S)-3-amino-2-hydroxypropionyl)을 붙인 반합성 항생제인 이세파마이신 (isepamicin)은 아미노글라이코사이드 불활성화 효소에 분해되지 않으며 활성은 유지되는 물질이다. 본 논문에서는 isepamicin의 전구물질인 gentamicin B의 생합성 경로를 집중적으로 연구하여 C6′과 C2′부분의 아미노화와 탈아미노화 관련한 생합성 경로를 규명하고 메커니즘을 연구하는 것을 목표로 하였다. 본 논문의 3장에서는 gentamicin B 6′탄소의 아미노화에 관여하는 생합성 과정을 시험관내 효소반응을 통해 규명하였다. 탈수소효소 (dehydrogenase)인 GenQ와 아미노 전이 효소 (aminotransferase)인 GenB1은 gentamicin B로 가는 네가지의 복합적인 생합성경로에서 6′탄소의 아미노화에 관여를 한다. 화학 합성과 효소 합성을 통해 얻은 gentamicin B 생합성 중간체들을 GenQ-GenB1과 시험관내 효소반응을 하였을 때 각 기질마다 활성이 다르며, 이는 GenQ-GenB1이 기질 특이성을 가지고 있음을 나타낸다. 기질 특이성에대한 단백질 구조적 특징을 보기 위해 GenB1의 단백질 구조를 규명하였고 GenB1 단백질의 퍼널(funnel)모양이 기질에 대한 단백질의 활성에 영향을 주는 것을 확인하였다. 기질에 대한 GenQ-GenB1의 특이성이 생산균주에서의 gentamicin B의 생산성 저해에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 본 논문의 4장에서는 gentamicin B로 가는 2′탄소의 탈아미노화에 관여하는 생합성 과정을 시험관내 효소반응을 통해 규명하였다. 이산소화효소 (dioxygenase)인 GenJ와 환원효소(dehydrogenase)인 GenK2가 gentamicin B로 가는 생합성 경로에서 2′탄소의 탈아미노화에 관여한다. GenJ와 GenK2는 이전에 밝혀진 gentamicin 생합성 유전자 집단에 존재하지 않음에도 gentamicin B로가는 핵심 중간체인 JI-20A에 대해 높은 활성을 가지고 있다. 생산 균주에서의 gentamicin B의 낮은 생산성에대한 이유를 뒷받침하기위해 전사 분석을 반 정량적 RT-PCR (semi-quantitive RT-PCR)로 수행하였다. GenJ-GenK2와 다른 유전자들의 전사 정도를 비교하였을 때 GenJ-GenK2가 다른 유전자들에 비해 낮은 발현을 나타냄을 확인하였고 이는 생산균주에서의 gentamicin B의 낮은 생산성의 이유를 뒷받침해 줄 수 있는 근거가 된다. 이상의 연구결과는 아미노글라이코사이드 계열 항생제인 gentamicin B로 가는 생합성 경로 중 6′탄소와 2′탄소의 아미노화와 탈아미노화에 관련한 생합성 과정을 규명하고 생산균주에서의 gentamicin B의 낮은 생산성에 대한 이유를 단백질 구조와 미생물내 유전자 전사 조절 측면에서 밝힌 첫 보고이다. 이는 향후 미생물내 생합성 경로 조작을 통한 신규 아미노글라이코사이드 계열 항생제의 개발 및 연구에 기여할 것으로 예측된다.