β-carotene inhibits colon cancer by suppressing tumor-associated macrophages and tumor-associated fibroblasts

Abstract

Tumor-associated macrophages (TAMs) and Tumor-associated fibroblasts (TAFs), both are major components of tumor microenvironment (TME), are related to the progression and metastasis of colon cancer cells, which induces poor outcomes. Since the complex interactions between stromal cells and cancer cells exist, macrophages are polarized into M2 type macrophages, TAMs, and fibroblasts are activated to become TAFs. β-carotene (BC), one of the provitamin A with antioxidant activity, exhibits anti-cancer effects against several types of cancer. However, the effect of BC on modulating macrophage polarization and fibroblast activation remains unknown. The aim of our in vitro study is, firstly, to examine the effect of BC on macrophage polarization and fibroblast activation. Human monocyte, U937 cells were polarized into TAMs by treating phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and interleukin (IL)-4. M2 macrophage polarization markers, CD163, ARG-1, TGF-β1, and PPARγ were significantly inhibited by BC both in mRNA and protein levels, which involves IL-6/ Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) molecular pathways. In addition, conditioned media (CM) from TAMs treated with BC were collected and treated into HCT116 cancer cells. BC-treated TAMs CM significantly suppressed cancer stem cells (CSCs) markers. To understand the effect of BC on fibroblast activation, TGF-β1-induced CCD18Co cells (TAFs) were used. Our results demonstrated that BC significantly suppressed the mRNA expressions of the activated fibroblast markers, including α-SMA, FAP, and TGF-β1 and the protein expressions of EMT markers including Vimentin. Moreover, CM from TAFs treated with BC were collected and treated into HCT116 cancer cells. BC-treated TAFs conditioned media down-regulated an EMT-inducing molecule, TGF-β1, a mesenchymal marker, α-SMA, and upregulated an epithelial marker, E-cadherin. In addition, BC-treated TAF CM inhibited migration and invasion of colon cancer cells. Azoxymethane (AOM)/Dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis-associated CRC model was used to confirm the in vitro results. Mice were divided into four groups; 1) Normal control group (Ctrl), 2) AOM/DSS-induced colorectal cancer control group (CC), 3) AOM/DSS-treated + 5 mg/kg b.w. of beta-carotene (BC5), 4) AOM/DSS-treated + 15 mg/kg b.w. of beta-carotene (BC15). Intraperitoneal injection of AOM and 2% DSS in normal drinking water were administered into mice. DSS treatment began 1 week after injection of AOM and provided for 7 days followed by two weeks of resting period. Same cycle was repeated one more time with an additional 2 weeks of resting period. Disease activity index (DAI) score was generally suppressed by BC. The number, multiplicity, and size of tumors were remarkably decreased in BC group compared to the CC group. Consistent with the in vitro data, BC suppressed M2 macrophage polarization and CSCs markers in colon. In conclusion, our findings demonstrate that BC mediates TME by regulating TAMs and TAFs in colon cancer in vitro and in vivo study and thereby apply to potential anti-cancer therapy in colon cancer.;베타카로틴의 종양관련 대식세포 및 종양관련 섬유아세포 조절을 통한 대장암에 미치는 효과 규명 본 연구에서는 베타카로틴이 종양미세환경의 주요 구성 요소인 종양관련 대식세포 및 종양관련 섬유아세포의 조절을 통하여 대장암에 미치는 효과를 규명하였다. 대장암은 전 세계적으로 흔하게 발병하는 암의 일종으로 여러 가지 복합적인 요인에 의해 발생하지만, 최근에 만성염증성 장질환과 같은 염증성 미세환경의 조성이 종양의 발생에서 전이까지 기여한다고 밝혀지고 있다. 다시 말해, 종양 세포와 그 주변의 종양 기질세포로 알려진 종양관련 대식세포와 종양관련 섬유아세포의 복 합적인 상호작용이 발생하는 종양미세환경이 항암과 관련된 연구의 주된 표적이다. 베타카로틴은 일부 암에서 항암효과가 이미 밝혀졌으나 대장암에서 여러 물질과 세포들 간의 복잡한 상호작용이 존재하는 종양미세환경을 표적으로 한 항암 기능에 대해 아직 많이 연구되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 베타카로틴의 종양미세환경의 주요 두 요소인 종양관련 대식세포와 종양관련 섬유아세포의 조절을 통해 대장암에 항암효과를 낼 것이라는 가설을 세웠다. 이를 규명하기 위해 세포실험및 동물실험을 진행하였다. 먼저, PMA를 처리하여 단핵구 U937을 대식세포로 분화시키고 IL-4를 추가로 처리하여 유도시킨 종양관련 대식세포의 경우, 베타카로틴의 처리에 따라 종양관련 대식세포의 마커인 CD163, ARG1, TGF-β1의 mRNA 발현 및 CD163, PPARγ의 단백질 발현이 감소함을 확인하였다. 더불어, 종양미세환경에 존재하는 여러 종류의 분자들 중에 대식세포의 분화와 수렴에 관여한다고 알려진 IL-6에 초점에 맞추어 베타카로틴이 종양관련 대식세포에 미치는 영향을IL-6/STAT3 신호 전달 경로를 통해 부분적으로 밝혀 내었다. 베타카로틴의 영향을 받은 종양관련 대식세포의 대장암 세포에 미치는 영향을확인하고자, 종양미세환경을 세포 수준에서의 간접적 공동 배양을 통해 유도하여 대장암 세포에서 암 줄기세포 마커인 CD133, CD44, Notch1, Sox2의 발현이 억제됨을 확인하였다. 그리고 TGF-β1을 CCD-18Co에 처리하여 유도한 종양관련 섬유아세포의 경우, 베타카로틴을 처리함에 따라 섬유아세포 활성 마커인 α-SMA, FAP, TGF-β1의 mRNA 발현 및 EMT (Epithelial mesenchymal transition) 마커들의 단백질발현이 감소함을 확인하였다. 또한, 베타카로틴의 영향을 받은 종양관련 섬유아세포의 대장암 세포에 미치는 효과를 확인하기 위해 세포 수 준에서의 공동배양 모델을 이용하여 EMT 마커들의 mRNA 및 단백질 발현이 낮아졌음을 관찰하였다. 이에 따라 세포 실험에서 확인된 결과를 동물 실험에서도 확인하기 위해 azoxymethane (AOM)과 dextran sodium sulfate (DSS)의 처리를 통한 대장암 유도모델을 이용하였다. 베타카로틴을 섭취한 군에서는 DAI 점수가 유의적으로 감소하였고, 종양 발생은 100%이지만 종양의 개수, 크기도 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 그 다음으로는 베타카로틴을 섭취한 마우스의 직장 쪽에서 나타나는 종양관련 대식세포의 침투 정도가 베타카로틴을 섭취하지 않은 마우스보다 덜 침투된 것으로 나타났고, 대장에서의 종양관련대식세포와 관련된 마커들의 mRNA 및 단백질 발현도 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 복잡한 상호작용이 존재하는 종양미세환경에서 베타카로틴이 종양관련 대식세포와 종양관련 섬유아세포를 조절함으로써 대장암의 예방 및 치료에 긍정적인 효과가 있음을 시사한다.