KDM5B-mediated effects of glutamine deficiency on cell viability of Non-small cell lung cancer cells

Abstract

NSCLC is a type that accounts for more than 80% of lung cancer, which is the leading cause of cancer death. Cancer cells produce energy through altered metabolism such as aerobic glycolysis and glutaminolysis to support cell growth under hypoxic condition due to rapid proliferation. Although glutamine is a non-essential amino acid, its role turns into crucial in cancer cells as an alternative energy source. Activation of glutaminolysis, which converts glutamine to α-KG by GLS and GDH, has been connected to epigenetic alteration because several epigenetic modifiers depend on α-KG. Despite previous studies showed glutamine deprivation lowered cell viability, the molecular mechanism underlying glutaminolysis effect on cell proliferation was not fully understood. In this study, we focused on a possible mechanism by which glutamine contributes to cell proliferation of NSCLC cell using A549 and H1299. It was revealed that glutamine deprivation significantly lowered cell viability, suggesting that glutamine is crucial in NSCLC cell similar to the effect of essential amino acids. We found that HIF1A significantly bound on low glutamine DEGs by analyzing publicly available dataset, indicating that transcriptional changes upon glutamine deprivation have a common property shared with hypoxia. Indeed, the combination of hypoxia further maximized the glutamine deficiency effect. Based on this, we further analyzed overlapped DEGs in both hypoxia and glutamine deprivation by using additional GEO dataset. It was analyzed that KDM5B significantly binds to the promoter of overlapped DEGs and siRNA mediated knock-down KDM5B reduced cell viability similar to glutamine deprivation, which implies that KDM5B plays a key role in the glutamine deficiency mechanism. Since KDM5B is a histone dimethyl enzyme dependent on α-KG, we next tested whether α-KG deficiency due to glutamine deprivation would interfere with the KDM5B-mediated mechanism of cell viability regulation to lower cell viability. Supplement of α-KG partially restored the effect of glutamine deprivation on cell viability, identifying that glutamine deficiency reduced cell viability through a KDM5B-mediated mechanism. We further elucidated that KDM5B reflected the effect of glutamine deprivation through DNA damage, based on the increased expression of the DNA damage marker GADD45α. In particular, the expression levels of KIF20A, CCNB1, and CCNB2 that are involved in the cell cycle were lowered in both glutamine-depleted cells and KDM5B-knockdowned cells, indicating that KDM5B exhibited the effect of glutamine deprivation through cell cycle control. In summary, glutamine deprivation lowered cell viability thorough KDM5B mediated DNA damage and downregulation of cell cycle. ;비소세포폐암은, 암 사망의 주요 원인인 폐암의 80%를 차지하는 유형이다. 암세포는 빠른 증식 속도로 인한 저산소증환경에서 세포의 성장을 뒷받침하기 위해 에너지 자원의 대사과정을 바꾼다. 글루타민은 비필수 아미노산이지만 암에서는 대체 에너지 자원으로서 중요한 역할을 한다. 글루타민이 글루타민 분해효소와 글루탐산 탈수소효소에 의해 알파 케토글루탐산으로 변환되는 글루타민 분해의 활성은 여러 후성유전 변형인자들이 알파케토글루탐산에 의존적이기 때문에 강조되고 있다. 글루타민 결핍이 세포 생존력을 낮춘다는 연구들은 많지만 이의 후성유전 변형인자들을 포함하는 분자생물학적 메커니즘은 완전히 해명되지 않았다. 이 연구에서는 비소세포 폐암의 세포모델인A549와 H1299를 사용하여 글루타민이 비소 세포 폐암의 세포 증식에 기여하는 메커니즘을 알아보았다. 글루타민 결핍은 확연하게 세포 생존력을 감소시켰고, 특히 자가사멸에 의한 세포사멸이 증가하여, 글루타민이 필수 아미노산처럼 비소세포폐암 세포의 생존력에 중요함을 보였다. 우리는 후보 메커니즘을 알아보기 위해 기존에 발표된 데이터를 이차가공하여 분석하였다. 글루타민 결핍에 따라 발현이 달라지는 유전자들에 HIF1α 의 결합 모티프가 유의적으로 많이 존재하는 것을 확인하였으며, 이는 글루타민 결핍에 따른 발현 변화 유전자들이 저산소증 환경에서 유도되는 발현에 있어서 공통된 표적이 될 수 있음을 시사했다. 실제로, 저산소증 유사 조건과 글루타민 결핍을 결합하여 세포 생존력을 확인하였을 때 글루타민 결핍만 진행한 경우와 유사하거나 보다 감소한 영향을 보여 공통된 기전이 존재한다고 가정할 수 있었다. 이를 토대로, 후보 기전을 도출하기 위해 글루타민 결핍과 저산소증 유사 조건에서 공통되게 발현량이 달라진 유전자들의 특징을 분석하였다. 그 결과, 후성유전 조절인자인 KDM5B 결합 모티프가 유의적으로 도출되었다. siRNA를 이용하여 KDM5B 발현을 억제하면, 글루타민 결핍과 비슷하게 세포 생존력을 감소시켰다. KDM5B는 알파 케토글루탐산에 의존하는 히스톤 라이신 탈메틸화 효소이기 때문에, 글루타민 결핍에 의한 알파 케토글루탐산 생성 부족이 세포 생존력을 조절하는 KDM5B 매개 메커니즘을 방해하여 세포 생존력을 낮추는지 여부를 다음으로 시험했다. 글루타민 결핍 조건에 알파 케토글루탐산을 보충한 경우 세포 생존력에 있어 글루타민 결핍 효과를 제한적으로나마 회복시켰고, 이 알파 케토글루탐산 보충 효과는 글루타민 분해 경로에 중요한 효소의 저해제와 함께 처리하였을 때에도 유사하게 나타났다. 더 나아가 글루타민 결핍이DNA 손상 마커인 GADD45α의 발현을 증가시킨 결과를 토대로KDM5B가 DNA 손상을 통해 글루타민 결핍의 효과를 나타내는 가능성을 도출해냈다. 특히, 세포주기에 관여하는 KIF20A, CCNB1 및 CCNB2의 발현 수준은 글루타민 결핍된 세포 및 KDM5B가 발현하지 않는 세포 모두에서 낮아졌으며, 이는 글루타민 결핍이나 KDM5B발현 억제의 경우 DNA 손상에 반응하여 세포주기 차단이 일어나는 것을 보여준다. 이 결과들을 통해 본 연구는 글루타민 결핍이 알파 케토글루탐산 생성을 저해하여 후생유전학적 지표인 KDM5B의 역가를 억제함으로써 DNA 손상, 특히 세포 주기 차단을 통해 세포 생존력을 낮춘다는 결과를 도출할 수 있었다. 이와 같은 결과는 글루타민 분해경로와 KDM5B가 향후 비소 폐암의 암표적치료 개발의 기초적인 자료로 가치가 있다고 사료된다.