Differences in the distribution of microbiota and bacteria-derived extracellular vesicles between patients with gastric cancer and healthy controls

Abstract

Background and Objectives Viral and bacterial infections facilitate carcinogenesis in certain organs. For example, the secretion of virulence factors by Helicobacter pylori causes oxidative stress, chronic inflammation, and host DNA damage, resulting in carcinoma development. Recent studies indicated that changes of gut microbiota contribute to the development of chronic diseases including cancer, and bacteria-derived extracellular vesicles (EVs) are important for host-microbe communication. The aims of this study were to evaluate the composition of the microbiota between a gastric cancer group and control group and to develop a diagnostic algorithm for gastric cancer. Materials and Methods As the case group, the gastric cancer group included patients diagnosed with gastric cancer at Elwha Womans University Mokdong Hospital and who were admitted for surgery between September 2016 and September 2017. As a control group, patients without underlying disease who came to Haeundae Paik Hospital for medical checkup were evaluated. After matching with age and sex, finally 118 healthy control patients and 94 gastric cancer patients for urine samples, 163 healthy control patients and 73 gastric cancer patients for plasma samples, 120 healthy control patients and 67 gastric cancer patients for stool-EVs samples, and 116 healthy control patients and 63 gastric cancer patients for stool-bacteria samples were analyzed. Microbiota from the stools and EVs from the urine, plasma, and fecal samples were analyzed by 16S rDNA amplicon sequencing. The marker selection criteria were a sequencing depth greater than 1500, average greater than 0.005, t-test result less than 0.05, and fold-change of more than 2 among the markers found to differ from the control group. The final markers were selected using a stepwise selection method. We developed an algorithmic model by logistic regression and verified this model by internal validation. Results The composition of the microbiota differed significantly between the healthy control and gastric cancer groups. For urine samples, Proteobacteria (p) EVs were decreased (29.4 ± 13.5% vs. 38.3 ± 17.4% in the case vs. control groups, p 〈 0.01) and Firmicutes (p) EVs were increased in the cancer group (34.7 ± 29.4% vs. 29.4 ± 8.5%, p = 0.02). Particularly, Proteus (g) and Morganella (g) in the Proteobacteria (p) showed significant changes and were selected as markers. For plasma samples, Actinobacteria (p) EVs were decreased in the cancer group (9.3 ± 5.2% vs. 11.3 ± 7.3%, p 〈 0.01). Additionally, Micrococcus (g) in Actinobacteria was selected as a marker. For EVs from fecal samples, Proteobacteria (p) were decreased in the cancer group (9.4 ± 9.8% vs. 19.0 ± 17.2%, p 〈 0.01). Proteus (g) and Cupriavidus (g) in the Proteobacteria (p) were selected as markers. For bacteria from fecal samples, Cyanobacteria (p) were decreased in the cancer group (0.06 ± 0.4% vs. 0.4 ± 0.8%, p 〈 0.01). Particularly, YS2 (o) in the Cyanobacteria (p) was selected as a marker. For internal validation, the proposed algorithm using the selected markers was accurate based on the AUC values of 0.9324, 0.7672, 0.8878, and 0.8889 in the urine, plasma, EVs of the stool, and bacteria of the stool, respectively. Conclusions Taken together, these data revealed that there were significant differences in the distribution of microbiota and EVs between the healthy control and gastric cancer groups. The diagnostic algorithm developed using these results was particularly accurate when urine and stool samples were used. Further studies including external validation are needed.;배경 및 목적 각종 바이러스 및 세균성 감염은 특정 장기에서 암의 발생을 촉진한다. 예를 들면, 헬리코박터 균이 분비하는 독성 인자는 위 점막에 산화 스트레스, 만성 염증 상태를 야기하고, 결국 숙주인 인체의 DNA 손상을 유발하여 암을 일으키게 된다. 최근 연구에서는 이러한 인체내 미생물총의 변화가 암을 포함한 만성 질환의 발병에 기여하고, 특히 세균에서 유래한 나노 소포체는 숙주인 인체와 미생물 간의 신호 전달에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 위암 환자와 건강 대조군 사이의 미생물총 및 세균유래 나노 소포체의 분포를 비교 분석하고, 이를 통해 위암 진단을 위한 알고리즘을 개발해 보고자 하였다. 재료 및 방법 위암 환자군은 이화여대 목동병원에서 위암으로 진단받고 2016년 9월부터 2017년 9월까지 수술을 받기 위해 입원한 환자를 대상으로 하였으며, 건강 대조군은 해운대 백병원에서 건강 검진을 위해 내원한 동반 질환이 없는 환자를 대상으로 하였다. 최소한의 비뚤림 보정을 위해 나이와 성별이 차이 없도록 두 그룹을 짝지은 뒤, 최종적으로 소변 시료는 118명의 대조군과 94명의 위암 환자군에서, 혈장 시료는 163명의 대조군과 73명의 위암 환자군에서, 대변-소포체 분석 시료로는 120명의 대조군과 67명의 위암 환자군에서, 대변-세균 분석 시료로는 116명의 대조군과 63명의 위암 환자군에서 수집하였다. 미생물총은 대변 시료에서, 세균유래 나노 소포체는 소변, 혈장, 대변 시료에서 분석하였고, 16S rDNA를 염기서열 분석하는 기법으로 메타게놈 분석을 시행하였다. 한편, 알고리즘 개발을 위한 표지자 선택 기준으로는 시퀀싱 깊이가 1500 이상, 평균 분포 비율이 0.5% 이상, t 검정 결과 0.05 미만 및 대조군과의 차이가 2배 이상인 것으로 정하였고, 최종 표지자는 단계적 선택법을 사용하여 선택하였다. 로지스틱 회귀 분석을 이용하여 알고리즘 모델을 개발하고, 내부 검증을 통해 이 모델을 검증하였다. 결과 미생물총의 조성은 건강 대조군과 위암 환자 사이에 유의한 차이가 있었다. 소변 시료의 경우, 위암 환자군에서 Proteobacteria (p) 소포체의 감소 (위암 29.4 ± 13.5% 대 대조군 38.3 ± 17.4%, p < 0.01), Firmicutes (p) 소포체의 증가 (위암 34.7 ± 29.4% 대 대조군 29.4 ± 8.5%, p = 0.02)가 관찰되었다. 특히, Proteobacteria (p)의 Proteus (g)와 Morganella (g)는 뚜렷한 변화를 보여, 표지자로 선택되었다. 혈장 시료의 경우, 위암 환자에서 Actinobacteria (p) 소포체가 감소하였고 (위암 9.3 ± 5.2% 대 대조군 11.3 ± 7.3%, p < 0.01), 이 중 Micrococcus (g)가 표지자로 선택했다. 대변 시료에서 얻은 소포체의 경우, 위암 환자에서 Proteobacteria (p)가 감소하여 (위암 9.4 ± 9.8% 대 대조군 19.0 ± 17.2 %, p < 0.01), 이 중 Proteus (g)와 Cupriavidus (g)를 표지자로 선택했다. 대변 시료에서 분석한 미생물총의 경우, 위암 환자에서 Cyanobacteria (p)가 감소했고 (위암 0.06 ± 0.4% 대 대조군 0.4 ± 0.8%, p < 0.01), 그 중 YS2 (o)가 표지자로 선택되었다. 개발된 알고리즘을 내부 검증한 결과, 소변, 혈장, 대변의 소포체, 대변의 미생물총에서 각각 0.9324, 0.7672, 0.8878, 0.8889의 AUC 값을 보였다. 결론 본 연구에서는 건강한 대조군과 위암 환자군 사이의 미생물총과 세균유래 나노 소포체의 분포는 유의한 차이가 있음을 보여주었다. 이러한 결과를 사용하여 개발한 위암 진단 알고리즘은 소변과 대변 시료를 사용했을 때 특히 정확했으며, 향후 외부 검증을 포함한 추가 연구가 필요하다.