Cross-linked abnormal HSP27 dimer induced by small molecules sensitizes NSCLC cells to gefitinib or cisplatin

Abstract

It is the role of Heat shock protein 27 (HSP27) to inhibit apoptosis by diverse stimuli. Many clinical trials have showed the correlationship between HSP27 and active cancers, metastasis, stimulating drug resistance and poor patient outcomes. Over-expression of HSP27 have been discovered in various types, including non-small cell lung cancer (NSCLC). Thus, in NSCLC patient, to inhibit the expression of HSP27 may be a good strategy of cancer therapy. However, unlike HSP90 or HSP70, HSP27 doesn’t have an ATP binding pocket that is a hard to target. Although, HSP27 is important as an anti-cancer target, there’s no effective HSP27 inhibitor exist. Previously, we discovered small molecules, Zerumbone (ZER), SW15 and J2 induced cross-linked abnormal HSP27 dimer, inhibited the development of a large-size oligomer and cause to sensitization in combination with irradiation and chemotherapy. In this study sensitization effects of HSP-49, a chromenone compound like J2, but with more druggability in combination with anti-cancer drugs like cisplatin and gefitinib were examined. For this purpose, at first, 6 NSCLC cell lines contingent upon a EGFR mutation were selected. Two of them, NCI-H460 and A549 are EGFR wild-type (WT) cell lines, the other four HCC827, PC9, NCI-H1650, and NCI-H1975 are EGFR mutant-type (MT) cell lines. The HSP27 was expressed more in EGFR MT cell lines than EGFR WT cell lines. To confirm the sensitivity from each cell lines with drugs, cisplatin (cytotoxic drug), gefitinib (EGFR mutation targeting drug) and HSP-49 (that altered HSP27 dimerization inducer, which inhibits HSP27 functions) were used. EGFR WT cell line showed a result of increasing sensitivity from all three drugs in dependent manner to the degree of expression of HSP27. When the cytotoxic drug, cisplatin, was treated in combination with J2 or HSP-49 in the NCI-H460 cell lines, it showed sensitization. Moreover, sensitization by HSP-49 was absolutely in HSP27-dependent manner. Knock-down of HSP27 in NCI-H460 cell line caused the decrease in sensitization effects. In the case of gefitinib treatment in the EGFR MT cell lines, HSP27 showed a result of increasing the dependent sensitivity to the expression level, however, HSP-49 showed opposite results. Also, in EGFR MT cell lines, both J2 and HSP-49, when combined with the gefitinib, sensitization effects were detected. Tumor growth inhibition effects for cisplatin and HSP-49 in the BALB/c nude mouse xenograft model with injection of the NCI-H460 cells was also confirmed. Administered in combination with other anti-cancer agents by forming abnormal dimer in HSP27, HSP-49 is thought to be a good candidate to overcome the resistance to anti-cancer drugs.;폐암은 전세계적으로 다양한 암 종에 있어서 발병률이 높고, 진단에 따른 사망률도 높은 질환이다. 세포의 형태에 따라 소세포폐암과 비소세포폐암으로 나뉘는데, 전체 폐암 환자 중 약 85% 정도가 비소세포폐암을 앓고있다. 비소세포폐암 환자의 대부분은 폐 선암이며, 이들에게서 EGFR의 돌연변이가 많이 나타나 있다고 알려져 있다. EGFR의 돌연변이로 인해 세포 성장 및 분화에 대한 신호가 계속적으로 활성화 되어 암세포의 과도한 증식이 일어나게 된다. 이 외에도 폐암 환자에게서 HSP27 의 발현이 높게 나타난다는 연구 결과도 잘 알려져 있다. HSP27은 27kDa의 열충격 단백질로 다양한 자극에 의한 세포사멸을 억제하는 샤페론적인 역할을 한다. 많은 임상연구에서 HSP27은 암 전이, 항암 내성 등의 좋지 않은 예후와 관련이 있음이 알려졌고, 비소세포폐암을 비롯한 다양한 암종에서 HSP27이 과발현 되어 있음이 확인되었다. 이에 따라, HSP27의 발현을 억제하는 것이 비소세포폐암 치료에 좋은 전략이 될 수 있을 것으로 예상된다. 하지만, HSP27은 HSP90이나 HSP70과는 달리 ATP-binding pocket이 없어 약물 스크리닝이 어려운 단백질이다. 따라서 현재 효과적인 HSP27 억제제가 나와있지 않은 실정이다. 선행연구에서 Zerumbone (ZER), SW15, 그리고 J2가 HSP27의 비정상적인 이량화를 유도함으로써 large oligomer의 형성을 막아, 방사선이나 화학요법과의 병용 처리시 민감성이 증가되는 것을 확인하였다. 하지만 J2의 낮은 용해도와 짧은 pKa 값으로 의약품으로서의 한계점을 갖고 있다. 그래서 이러한 단점을 개선한 HSP-49라는 화합물을 찾아 본 연구를 진행하였다. HSP-49는 비정상적인 HSP27의 이량화를 유도하는 데에 있어서 J2와 비슷한 효과를 나타내는 화합물이다. 이에 따라, 본 연구에서 NSCLC 세포주 들에 있어서 EGFR 정상 세포주와 EGFR 돌연변이 세포주로 나누어 현재 임상에서 사용하고 있는 세포독성 항암제인 cisplatin과 EGFR 돌연변이 표적 항암제인 gefitinib, 그리고 HSP27를 억제할 수 있는 HSP-49를 갖고 세포사멸에 대한 민감성 정도를 확인하였다. 또한 더 나아가, cisplatin 또는 gefitinib을 HSP-49와 병용 처리하여 그 결과를 확인하였다. 병용화학요법은 암세포들의 이질성과 약물에 대한 내성을 이유로 널리 쓰이는 치료법이다. 우선, NSCLC 세포주 중, EGFR 정상 세포주인 NCI-H460에 세포독성 항암제인 cisplatin과 HSP-49를 함께 병용 처리하였을 때, 세포 사멸 증진 효과를 확인할 수 있었다. 또한, HSP-49에 대한 증진 효과가 HSP27을 매개하여 나타나는 효과임을 확인하였다. 그 다음으로, EGFR 돌연변이 세포주인 HCC8272, PC9, NCI-H1650 그리고, NCI-H1975에 EGFR 돌연변이 표적 항암제인 gefitinib과 HSP-49를 병용처리 한 결과에서도 세포사멸 증진효과를 확인하였다. 그런데, gefitinib 민감성 세포주인 HCC827과 PC9의 세포 사멸 증진효과는 gefitinib 내성 세포주인 NCI-H1650과 NCI-H1975에 비해 미미한 정도로 나타나는 차이를 확인 하였다. 세포에서의 실험 결과를 바탕으로, 마우스 모델을 이용한 동물실험을 진행하였다. EGFR 정상 세포인 NCI-H460 세포를 이식하여 약 2주간 cisplatin과 J2 또는 HSP-49를 단독 또는 병용 주사하여 암 조직의 크기를 측정하였을 때, 단독 주사보다는 병용 주사하였을 때, 암 조직의 성장속도가 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로, HSP-49는 HSP27의 변형된 이량화를 유도하는 화합물로 다른 항암제와의 병용 화학요법을 통해 항암제 내성을 극복하기 위한 좋은 전략이 될 것으로 생각하는데, 실제 환자 치료에 있어서 gefitinib에 대해 내성을 갖는 환자에게서 그 효과가 더욱 잘 나타날 것으로 생각된다.