Engineering of Candida antarctica Lipase B to Improve Regioselectivity toward Monoacyl Glycerols

Abstract

Monoacyl glycerols (MAGs), which have excellent antimicrobial activities and moisturizing effects [1-5], are difficult to produce with enzymes to a high yield [6, 7]. Diacyl glycerols (DAGs) were often produced as by-products. Thereby, Candida antarctica Lipase B (CALB) was engineered to improve regioselectivity to monoesterification of glycerol with medium chain fatty acids (e.g., nonanoic acid). First, I have performed the structural analysis of CALB and substrate docking simulation. It was supposed that one or more side chain residue substitution to larger and/or charged amino acids may improve the regioselectivity toward monoacylation. Therefore, several amino acid residues in the substrate binding region such as I189, L278, A282, and I285 were replaced with aspartic acid, glutamic acid, and/or phenyl alanine [8]. Single, double, and triple amino acid variants were constructed by site-directed mutagenesis method. Some of the CALB variants, A282EI285F and A282WI285F, showed substantially higher regioselectivity toward synthesis of MAGs. To characterize enzymatic properties of CALB and variants, pNP (para-nitrophenol) enzyme assay was performed. Specific activity (Unit/mg cell) of A282EI285F was higher than that of CALB. Also, kinetic constants, Vmax and kcat/Km of the A282EI285F were higher than CALB. To verify the properties of enzyme kinetics, structural analysis of modeling program was performed. Most of all, the size and shape of A282EI285F active site seemed to be changed to allow greater regioselectivity to monoacylation. I will continue to study the immobilization of free enzymes to intensify the heat, acid and, solvent resistance of free enzymes and to use enzymes at large scale-processes.;본 연구에서는 효소를 이용하여 중쇄지방산과 글리세롤을 결합시켜 높은 항균 능력 및 유화 능력을 가지고 있는 MAG을 생합성 하였다. 이 때, 효소를 이용하여 MAG을 생합성 할 경우 DAG이 부산물로 생성되어 MAG을 고순도로 생합성 하기 어렵다는 문제가 있다. 따라서 MAG에 높은 regioselectivity를 가지는 Candida antarctica 유래 Lipase B를 개발하여 MAG 생합성 수율을 높이고자 하였다. 먼저 Molecular modeling program을 이용하여 structural analysis와 substrate docking simulation을 진행하였고 그 결과를 토대로 치환해 줄 아미노산을 선정하였다. 그리고 MAG에 대한 regioselectivity를 향상시키기 위하여 타겟으로 선정한 아미노산을 두 가지 전략을 통하여 바꾸고자 하였다. 효소의 active site 크기를 줄이기 위하여 타겟 아미노산을 더 큰 아미노산으로 바꾸거나 효소의 active site를 높은 극성의 상태로 만들기 위하여 타겟 아미노산을 charge가 있는 아미노산으로 바꿔주었다. 따라서, site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 아미노산이 1개, 2개, 3개 바뀐 variants를 구축하였다. 아미노산이 2개 치환된 A282EI285F variant가 가장 향상된 결과를 보였으며 효소의 특성을 확인하기 위하여 para-nitrophenol을 이용한 pNP enzyme assay를 진행하였다. 또한, modeling program을 통하여 variant active site의 모양과 크기를 확인하였다. 효소의 특성이 기존의 CALB와 확연하게 달라졌으며 active site 또한 크기가 작아진 것을 확인할 수 있었다. 효소가 유기용매 상에서도 효율적으로 이용되기 위해서는 내열성, 내산성, 용매에 대한 안정성이 높은 고정화 된 효소를 이용해야 한다. 개발한 효소를 고정화를 통해 산업화 할 수 있다면 다양한 환경에서 esterification 반응을 촉매 할 수 있는 효소의 개발에 기여할 수 있을 것이라 사료된다.