ABCA4 프로모터 유전자 변이의 기능 검색 및 전사 조절 연구

Abstract

ATP-binding cassette, subfamily A, member 4 (ABCA4) 수송체는 망막의 광수용체에 위치하고 있으며, 이 수송체의 기질은 retinylidene-phosphatidylethanolamine이다. ABCA4 수송체는 retinylidene-phosphatidylethanolamine-PE를 판막에서 세포질 내로 수송함으로써 판막 안쪽에서의 축적을 방지한다. 선행 연구에서 많은 ABCA4 수송체의 유전자 변이가 Stargardt 병, 망막 색소변성증, 연령관련 황반변성, 원뿔세포-막대세포 이상증 등과 같은 다양한 형태의 망막 이영양증과 관련 있음이 알려졌다. 이와 같은 ABCA4 수송체의 임상적 중요성에도 불구하고, ABCA4 유전자 변이의 기능에 대한 연구는 거의 보고된 바가 없다. 본 연구는 한국인에서 ABCA4 프로모터 부위의 유전자 변이를 발굴한 후 각 변이 유전자의 기능 및 기전을 in vitro 실험을 통해 알아보았다. 먼저, 48명의 건강한 한국인으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여 직접 염기서열 분석을 통해 ABCA4 프로모터 부위를 분석하였다. 이어서 HCT-116 세포에서의 dual luciferase reporter assay를 통해 각 변이 유전자의 프로모터 활성을 측정하였다. 또한, ABCA4 전사 활성을 조절할 것으로 예측되는 전사 인자를 Consite 및 Mat Inspector 프로그램을 사용하여 검색하였고, 젤 지연 분석법을 통하여 확인하였다. 마지막으로, ABCA4 프로모터 활성에 대한 전사 인자의 영향을 알아보기 위해 전사 인자 과발현 후 프로모터 활성을 측정하였다. 그 결과, ABCA4 원위, 근위 프로모터에서 각각 8개, 3개의 유전 변이가 확인되었다. 또한, 근위 ABCA4 프로모터에서 4개의 일배체형이 확인되었다. 이 중 일배체형 2는 g.-761C>A 변이로 구성되어 있으며 wild-type과 비교했을 때 프로모터 활성이 유의하게 증가함을 보인 반면, g.-1086A>C로 이루어진 일배체형 3은 프로모터 활성이 유의하게 감소하였다. 더불어, 일배체형 1에 있는 g.-900A>T 변이 유전자의 프로모터 활성은 유의하게 증가하였다. 두 전사 인자, GATA-2와 HLF가 각각 g.-1086A>C 또는 g.-761C>A 그리고 g.-900A>T 유전자 변이 부위에 결합할 것으로 예측되었으며, wild-type과 변이 서열 간의 결합력이 매우 다를 것으로 예측되었다. 이러한 예측은 젤 지연 분석법을 통하여 확인되었다. 즉, 두 전사 인자는 각각 g.-1086A>C 또는 g.-761C>A, g.-900A>T가 있는 ABCA4 프로모터에 결합하였다. 특히, GATA-2는 g.-1086C 변이보다 g.-1086A wild-type과 강한 결합력을 나타냈고, g.-761C>A 변이에서는 g.-761C wild-type보다 g.-761A 변이와 더 강한 결합력을 보였다. HLF는 g.-900A wild-type보다 g.-900T 변이와 더 강한 결합력을 보였다. 끝으로 본 연구에서는 GATA-2와 HLF 모두 ABCA4 전사에 activator로 작용함을 알 수 있었다. 본 연구에서는 ABCA4 프로모터 일배체형이 ABCA4 유전자의 전사에 유의한 영향을 미치며, 이는 GATA-2와 HLF에 의해 조절됨을 알아냈다. 이와 같은 ABCA4 프로모터의 기능성 일배체형이 망막 이영양증의 감수성 또는 임상적 경과와 연관이 있는지 알아보기 위한 연구가 추가적으로 필요하겠다.;The ATP-binding cassette, subfamily A, member 4 (ABCA4) transporter is localized to the photoreceptor in the retina; the natural substrate of this transporter is retinylidene-phosphatidylethanolamine. ABCA4 transporter prevents accumulation of retinylidene-phosphatidylethanolamine-PE inside the disks by transporting it to the cytoplasmic side of the disk membrane. Previous studies reported that genetic variations in ABCA4 cause various forms of retinal dystrophies including Stargardt disease, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, and cone-rod dystrophy. In spite of the clinical importance of ABCA4 transporter, there were few studies to investigate the function of each ABCA4 variant. The purpose of this study was to identify and functionally characterize genetic variations of the ABCA4 promoter region in Koreans and to determine the mechanism by which ABCA4 variants alter promoter activity by in vitro assays. First, the promoter region of ABCA4 was amplified and directly sequenced using genomic DNA samples obtained from 48 healthy Koreans. Then, Promoter activity was measured using a dual luciferase reporter assay in HCT-116 cells. Potential binding sites for the transcription factors regulating ABCA4 transcriptional activity were predicted using software tools ConSite and Mat Inspector. Next, electrophoretic mobility shift assays were performed to validate the in silico predictions. Finally, promoter activity was measured after co-expression of the transcription factors to investigate the effect of transcription factors on the ABCA4 promoter activity. As a result, eight and three genetic variations were identified in the distal and proximal ABCA4 promoter, respectively. In the proximal promoter region, there were four major haplotypes. Among them, the H2 haplotype, consists of the variant g.-761C>A showed significantly increased promoter activity, compared to that of the wild-type, whereas the H3 haplotype, consists of the variant g.-1086A>C showed significantly decreased promoter activity. In addition, the variant g.-900A>T in the H1 haplotype exhibited significantly increased promoter activity. Two transcription factors, GATA-2 and HLF, were predicted to bind to the g.-1086A>C or g.-761C>A and g.-900A>T region, respectively, and showed very different binding affinities to the wild-type and variant sequences. This prediction was confirmed by electrophoretic mobility shift assays; both transcription factors could bind to the ABCA4 promoter in the region of g.-1086A>C, g.-761C>A, or g.-900A>T. GATA-2 showed higher binding affinity to the wild-type allele g.-1086A than to the variant allele g.-1086C, whereas as for the g.-761C>A, it showed higher binding affinity to the variant allele g.-761A allele than to the g.-761C wild-type allele. HLF showed higher binding affinity to the variant allele g.-900T allele than to the g.-900A wild-type allele. In addition, GATA-2 and HLF act as activators on the ABCA4 transcription. This study revealed that the common haplotypes of the ABCA4 promoter change ABCA4 transcriptional activity, which is regulated by GATA-2 and HLF. Further study will be necessary to investigate the effect of functional ABCA4 promoter haplotypes on the susceptibility or clinical course of retinal dystrophies.