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Functional characterization of FCN3 (ficolin-3), a gene as tumor suppressor in lung adenocarcinoma

Title
Functional characterization of FCN3 (ficolin-3), a gene as tumor suppressor in lung adenocarcinoma
Authors
김은정
Issue Date
2018
Department/Major
대학원 생명과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
김재상
Abstract
폐암은 조직학의 유형에 따라 크게 small-cell lung cancers와 non-small-cell lung cancers (NSCLC) 2가지 종류로 분류 된다. 특히 이 NSCLC의 하위 유형인 adenocarcinoma는 비흡연자들의 폐암에서 많은 부분을 차지한다. 폐암의 원인은 보통 흡연이지만, 비흡연자들의 adenocarcinoma 발생의 원인 중에 하나로 genetic mutation이 거론된다. 이 연구에서는 NSCLC의 새로운 driver mutation을 찾기 위해서 103명의 비흡연 여성 환자의 lung adenocarcinoma (LUAD) 조직 샘플로부터 유전자들을 선별했다. 그 유전자들 중 하나인 ficolin-3 (FCN3)는 정상 조직에 비해 암 조직에서 현저하게 발현이 감소되었다. 이 FCN3가 tumor suppressor일 것이라고 가정하고 실험을 통해 이 유전자가 폐암 세포와 관련하여 어떤 기능을 수행하는지 알아보기 위한 연구를 시작하였다. FCN3는 secretion 되는 단백질이며, lectin pathway와 관련된 유전자이다. 따라서 western blot 분석으로 cell lysate 뿐 아니라 supernatant에서도 단백질을 검출했다. 그리고 폐암 cell line들 (A549, H23)에서 FCN3를 과발현 시킨 후, colony formation assay를 이용하여 세포 증식 능력을 관찰하였다. 그 결과, colony 수가 negative control로 사용한 empty vector (EV)에 비해 매우 감소된 것을 확인할 수 있었다. Flow cytometry 분석을 통해 세포주기를 확인 했을 때 각 phase의 변화는 없었다. 이는 FCN3의 과발현에 의한 cell proliferation의 변화가 세포 주기와는 관련이 없음을 보여준다. 또한 폐암 cell line인 A549에 annexin V를 사용하여 apoptosis assay를 진행 한 결과, apoptotic cell들이 EV에 비해 상당히 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 발현된 FCN3가 포함된 supernatant를 A549에 넣어주었을 때도 apoptotic cell들이 EV에 비해 매우 증가함을 확인할 수 있었다. 이 결과들은 FCN3가 secretion 되어 발현하고, 과발현시 lung cancer cell line에서 proliferation을 억제하고 apoptosis를 유도한다는 것을 보여준다. 이는 LUAD에서 FCN3가 tumor suppressor로서 기능한다는 것을 나타낸다. FCN3는 폐와 간에서 발현되며 lectin pathway에서 인식 분자로 알려져 있다. 이 FCN3가 폐암에서 tumor suppressor로써 lectin pathway와 관련하여 어떤 상호작용을 하는지에 대한 차후 연구가 필요하다.;Lung cancers are typically classified into two types based on histological characteristics : small-cell lung cancers and non-small-cell lung cancers (NSCLC). Adenocarcinoma, a subset of NSCLC, occupies a large proportion of lung cancers found in non-smokers. the leading cause of adenocarcinoma in non-smokers is believed to be genetic mutations. In this study, to identify the new driver mutation in NSCLC, genes from lung adenocarcinoma (LUAD) tissue samples of 103 non-smoking female patients were screened for altered expression, One of the genes strongly down-regulated in tumor tissue was ficolin-3 (FCN3). We hypothesized that FCN3 is a tumor suppressor, and we conduct experiments to find out what function this gene plays in lung cancer cells. FCN3 is known as a secreted protein associated with the lectin pathway. Consistently the protein was detected not only in cell lysate but also in supernatant by western blot analysis. After overexpression of FCN3 in lung cancer cell lines (A549, H23), cell proliferation was examined using a colony formation assay. we observed that the number of colonies were significantly reduced compared with the empty vector (EV) used as a negative control. When the cell cycle was analyzed by flow cytometry, there was no change in each phase. This suggests that changes in cell proliferation by overexpression of FCN3 are not associated with the cell cycle. In addition, apoptosis assay using annexin V for lung cancer cell line A549 indicated that apoptotic cells were significantly increased compared to EV. Also, the supernatant containing secreted FCN3 protein was added to A549, apoptotic cells were significantly increased compared to EV. This study demonstrates that FCN3 inhibits cell proliferation and induces apoptosis in lung cancer cell line. These results indicate that FCN3 functions as a tumor suppressor gene in LUAD. FCN3 expressed in the lungs and liver, is known as a recognition molecule in the lectin pathway. Further studies are needed to determine whether FCN3 interacts with the lectin pathway in functioning as a tumor suppressor in lung cancer.
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