Role of the Hog1 mitogen-activated protein kinase in stress responses

Abstract

Survival of single-celled organisms depends on their ability to cope with numerous environmental insults, alternatively called stress. As a species of yeast Saccharomyces cerevisiae deals with stress by activation of two stress-activated protein kinase (SAPK) signal transduction pathways: the high osmolarity glycerol (HOG) pathway and the cell wall integrity (CWI) pathway. When exposed to stresses, yeast cells get damaged to their growth and metabolism and initiate adaptive program influencing cell physiology, transcription, cell cycle, and translation. In chapter 1, acetic acid inhibits the metabolic activities of Saccharomyces cerevisiae. Therefore, a better understanding of how S. cerevisiae cells acquire the tolerance to acetic acid is of importance to develop robust yeast strains to be used in industry. To do this, we examined the transcriptional changes that occur at 12 h post-exposure to acetic acid, revealing that 56 and 58 genes were upregulated and downregulated, respectively. Functional categorization of them revealed that 22 protein synthesis genes and 14 stress response genes constituted the largest portion of the upregulated and downregulated genes, respectively. To evaluate the association of the regulated genes with acetic acid tolerance, 3 upregulated genes (DBP2, ASC1, and GND1) were selected among 34 non-protein synthesis genes, and 54 viable mutants individually deleted for the downregulated genes were retrieved from the non-essential haploid deletion library. Strains overexpressing ASC1 and GND1 displayed enhanced tolerance to acetic acid, whereas a strain overexpressing DBP2 was sensitive. Fifty of 54 deletion mutants displayed enhanced acetic acid tolerance. Three chosen deletion mutants (hsp82Δ, ato2Δ, and ssa3Δ) were also tolerant to benzoic acid but not propionic and sorbic acids. Moreover, all those five (two overexpressing and three deleted) strains were more efficient in proton efflux and lower in membrane permeability and internal hydrogen peroxide content than controls. Individually or in combination, those physiological changes are likely to contribute at least in part to enhanced acetic acid tolerance. Overall, information of our transcriptional profile was very useful to identify molecular factors associated with acetic acid tolerance. In chapter 2, accumulation of hydrogen peroxide (H2O2) inside the cell results in oxidative modification of essential cellular macromolecules, which may lead ultimately to cell death and diseases. Upon exposure to sub-lethal doses of H2O2, yeast cells undergo rapid induction of antioxidant genes through transcriptional modulation, generation of reducing power in the form of NADPH, rapid inhibition of protein synthesis, and transient G2 cell cycle arrest. A hog1Δ strain of S. cerevisiae, in which the Hog1 MAP kinase-encoding gene is deleted, is sensitive to H2O2, indicating its role in defending H2O2. To test the role of Hog1 as a transcriptional modulator in H2O2 stress adaptation, we performed RNA sequencing analysis with a wild type (BY4741) and its isogenic hog1Δ strains untreated or treated with H2O2. We found that 100 genes and 82 genes were up-regulated with 69 genes common, and 72 genes and 70 genes were down-regulated with 49 genes common in respective BY4741 and hog1Δ. We analyzed the Hog1-dependent genes of BY4741 (31 non-common up-regulated and 23 non-common down-regulated) for functional category, interaction network, and promoters. Of deletion mutants for the non-common up-regulated genes, yap1Δ, sod2Δ, and mrps12Δ were sensitive to H2O2, but overexpression of their open reading frames did not rescue the growth defect of hog1Δ. In addition, none of the individual deletion mutants for the non-common down-regulated genes exhibited enhanced growth of BY4741. Taken together, transcriptional modulation by Hog1 in response to H2O2 does not support adaptation to the same stress. Accordingly, to define the role of Hog1 in H2O2 stress adaptation, its association with NADPH generation, protein synthesis inhibition, or cell cycle arrest needs to be investigated. In chapter 3, Hydrogen peroxide (H2O2) is known to simultaneously activate the HOG (high osmolarity glycerol) and CWI (cell wall integrity) pathways, which culminates in phosphorylating two mitogen activated protein kinases (MAPKs) Hog1 and Slt2, respectively. The absence of Hog1 renders cells sensitive to H2O2, whereas little is known for the effect of Slt2 on adaptation to H2O2. Based on the growth of Saccharomyces cerevisiae strains on the solid medium, five individual components (Bck1, Mkk1, Mkk2, Slt2, and Mlp1) and three downstream effectors (Rlm1, Swi4, and Swi6) of the CWI pathway are dispensable for adaptation to H2O2, but the Hog1 phosphorylation absolutely depends on the presence of Swi6. These results suggest that Hog1 phosphorylation is irrelevant to Hog1 activation in adapting to H2O2, contrary to the canonical notion in the field of signal transduction that activation and phosphorylation of MAPKs are used in much the same sense. Accordingly, it may be necessary to distinguish between activation and phosphorylation of Hog1 in adapting to other types of stress that are previously known to activate Hog1 in particular. To this end, the growth of cells deleted individually for HOG1 and SWI6, and Swi6-dependence of Hog1 phosphorylation should be examined under given stress conditions.;단세포 생명체의 생존은 많은 환경적 스트레스에 대처하기위한 능력에 달려있다. Saccharomyces cerevisiae는 효모의 한 종으로, 두 개의 스트레스에 의해 활성화되는 단백질 인산화 신화전달경로의 활성을 통해서 스트레스를 다룬다: HOG (high osmolarity glycerol) pathway와 CWI (cell wall integrity) pathway. 세포가 스트레스를 받으면 그들의 성장과 대사에 손상을 입으므로, 세포 생리, 전사, 세포 주기, 번역에 영향을 미치는 적응 반응을 시작한다. 첫 번째 장에서, 아세트산은 Saccharomyces cerevisiae의 대사 활성을 막는다. 그래서 S. cerevisiae 세포가 어떻게 아세트산에 대한 내성을 얻을 수 있는지 이해하는 것은 산업적으로 사용될 강력한 효모 균주를 개발하는 데 중요하다. 이 연구를 하기위해서 우리는 아세트산을 12 시간 처리한 후 일어나는 전사적인 변화를 조사했다. 이 때, 56 개와 58 개의 유전자가 각각 상향조절과 하향조절 되었다. 그리고 이것을 기능적으로 분류했을 때, 22 개의 단백질 합성 유전자와 14 개의 스트레스 반응 유전자가 각각 상향조절 유전자와 하향조절 유전자의 가장 높은 부분을 차지했다. 아세트산에 내성을 지닌 조절된 유전자들의 관계를 평가하기위해 3 개의 상향조절 된 유전자 (DBP2, ASC1, 그리고 GND1)가 34 개의 비 단백질 합성 유전자들 중에서 선택되었고, 하향조절 된 유전자들이 개별적으로 결손 된 54 개의 생존 가능한 돌연변이 균주가 비 필수적인 반수체 결손 라이브러리 (non-essential haploid deletion library)에서 회수되었다. ASC1과 GND1을 과발현시킨 균주는 아세트산에 대한 내성이 증가한 반면, DBP2를 과발현시킨 균주는 민감성이 증가했다. 54 개의 결손 돌연변이 균주 중 50 개가 아세트산에 대한 내성이 증가했다. 이 중, 3 개의 선택된 결손 돌연변이 균주 (hsp82Δ, ato2Δ, and ssa3Δ)는 벤조산에는 내성을 가졌지만, 프로피온산과 소르빈산에서는 아니었다. 더욱이 이러한 5 개 (2 개의 과발현과 3 개의 결손)의 균주는 대조군보다 효율적인 양성자 유출, 낮은 막 투과성, 그리고 낮은 세포 내부의 과산화수소 함량을 나타냈다. 개별적 혹은 결합에서, 이러한 생리적인 변화는 적어도 아세트산에 대한 내성 증가 부분에 기여할 것이라고 추측한다. 전체적으로, 우리의 전사적인 프로파일에 대한 정보는 아세트산 내성과 관련된 분자적은 요소들을 확인하는 데에 매우 유용하다. 두 번째 장에서, 세포 내부의 과산화수소 (H2O2) 축적은 필수적인 세포 내 거대분자의 산화적인 변경을 초래하고, 이것은 궁극적으로 세포 죽음과 질병을 일으킬지도 모른다. 아치사 량의 H2O2에 노출되면, 효모세포는 전사적인 조절을 통해 항산화 유전자의 빠른 유도, NADPH 형태의 환원력 생성, 단백질 합성의 빠른 억제, 일시적인 G2 세포주기 정지를 일으킨다. S. cerevisiae의 hog1Δ 균주는 Hog1 MAP kinase를 암호화하는 유전자가 결손된 것으로, H2O2에 방어적인 역할을 나타내면서, H2O2에 민감하다. H2O2 스트레스 적응에 대한 전사적인 조절로서 Hog1의 역할을 테스트하기위해 우리는 H2O2를 처리한 또는 처리하지 않은 야생형 (BY4741)과 이것의 동질 유전자형인 hog1Δ 균주를 가지고 RNA sequencing 분석을 수행했다. 우리는 BY4741과 hog1Δ 각각에서 100 개의 유전자와 82 개의 유전자가 상향조절 되었고, 그 중 69 개는 공통으로 상향조절 되었고, 72 개의 유전자와 70 개의 유전자가 하향조절 되었고, 그 중 49 개의 유전자가 공통으로 하향조절 되는 것을 확인했다. 우리는 BY4741의 Hog1 의존적인 유전자 (31 개의 비 공통적인 상향조절 된 그리고 23 개의 비 공통적인 하향조절 된)를 기능적 분류, 상호작용 네트워크, 그리고 프로모터에 대해 분석했다. 비 공통적인 상향 조절된 유전자에 대한 결손 균주 중에, yap1Δ, sod2Δ, 그리고 mrps12Δ은 H2O2에 민감하지만, 그들의 ORF (open reading frame)의 과발현은 hog1Δ의 성장결함을 복원시킬 수 없다. 게다가 비 공통적인 하향 조절된 유전자들에 대한 개별적인 결손 균주들 중 어떤 것도 BY4741의 증가된 성장을 나타내지 않았다. 종합하면, H2O2 반응에서 Hog1에 의한 전사적인 조절은 같은 스트레스에 대한 적응을 지지하지 않는다. 따라서, H2O2 스트레스 적응에서 Hog1의 역할을 정의하기 위해 이것의 NADPH 생성과의 관계, 단백질 합성 억제, 또는 세포주기 정지에 대해서 더 조사할 필요가 있다. 세 번째 장에서, H2O2는 HOG와 CWI 경로를 동시에 활성화시키고, 이것은 각각 두 개의 유사분열물질 단백질 인산화효소 (mitogen activated protein kinase, MAPK)인 Hog1과 Slt2를 인산화시킨다. Hog1이 없으면 세포가 H2O2에 민감해지는 반면, H2O2 적응에 대한 Slt2의 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 고체 배지에서 Saccharomyces cerevisiae의 성장에 기초해서 CWI 경로의 다섯개의 각각의 개별적인 구성성분 (Bck1, Mkk1, Mkk2, Slt2, Mlp1)과 세개의 다운스트림 작동인자 (Rlm1, Swi4, Swi6)는 H2O2 적응에 필수적이지 않지만 Hog1 인산화는 Swi6의 존재에 절대적으로 의존적이다. 이러한 결과는 신호전달 분야에서 기본이 되는 MAPKs의 활성과 인산화가 같은 의미로 사용된다는 개념과 대조적으로, Hog1 인산화가 H2O2 적응에 대한 Hog1의 활성과 관련이 없다는 것을 제시한다. 따라서 이전에 특히 Hog1을 활성화시키는 것으로 알려진 다른 스트레스 유형에 대한 적응에서 Hog1의 활성화와 인산화 사이를 구분하는 것이 필수적일지도 모른다. 끝으로, HOG1과 SWI6를 개별적으로 결손시킨 세포의 성장과 Hog1 인산화에 대한 Swi6 의존성이 주어진 스트레스 조건 하에서 조사되어야 한다.