Intracellular uptake mechanism of TCTP-PTD and its application to anti-cancer therapy

Abstract

Our laboratory has previously shown that human translationally controlled tumor protein (TCTP) contains, at its NH2-terminus, a protein transduction domain (PTD), alternately called a cell penetrating peptide (CPP), and MIIYRDLISH which was called TCTP-PTD. This thesis describes my investigations on how TCTP-PTD promotes protein internalization. TCTP-PTD was fused GFP and used to study TCTP-PTD uptake and intracellular trafficking. The roles of known endocytosis pathways were examined in the uptake and/or trafficking of TCTP-PTD using endocytic inhibitors such as cholesterol depletors (MCD and nystatin), an actin polymerization modifier (cytochalasin D), clathrin-dependent uptake inhibitor (chlorpromazine) and a dynamin depletor (dynasore). The localization of TCTP-PTD was determined using lipid raft and subcellular fractionations. It was shown that TCTP-PTD is internalized via lipid-rafts/caveolae-dependent endocytosis, suggesting that dynamin or actin is involved in the process. The TCTP-PTD was localized in the cytoplasm and cytoskeleton, by subcellular fractionation of A549 human lung carcinoma cells. To assess the suitability of TCTP-PTD as a potential antitumor drug, TCTP-PTD was fused to the proapoptotic KLA peptide (KLAKLAKKLAKLAK) which alone does not penetrate cell membrane, and it was investigated whether the KLA fused to TCTP-PTD is delivered inside cells and allowed to exhibit its proapoptotic activity. Toward this end, the effect of the fused complex (TCTP-KLA) was evaluated on cell viability and the uptake efficiency of KLA into various cell lines. The IC50 of TCTP-KLA was in the range of 7 to 10 mol/L. Morphological changes in the cell were formed by microscopy, that are suggesting of damage to micochondrial membranes, indicating that apoptosis has occurred. Also, the anti-tumor activity of TCTP-KLA in vivo was evaluated, by injecting it into xenografts of lung carcinoma cells in Balb/c nude mice. TCTP-KLA caused almost complete tumor growth inhibition and this inhibition was more dramatic than that caused by TAT-KLA. These results suggest that TCTP-PTD can enter cells and also be released into the cytoplasm, and therefore it can be used for peptide drug delivery. In summary of my findings reported in the thesis, TCTP-PTD was internalized into cells by lipid-raft/caveolae mediated endocytosis and partial macropinocytosis that was associated with dynamin and actin in A549 cells. In addition, using ER and subcellular fractionations, it was demonstrated that TCTP-PTD is released from cytoplasm into ER after entry. My study in the mouse xenograft model clearly suggests that TCTP-KLA has the potential to be useful in anti-cancer therapy at least in mice.;TCTP-PTD는 translationally controlled tumor protein (TCTP)의 N-말단에서 유래되었으며 10개의 아미노산으로 이루어져 있고, MIIYRDLISH 서열을 지니고 있다. TCTP-PTD 말단에 형광 단백질 및 펩타이드를 붙여 세포 내로 얼마나 잘 들어가는 확인하였다. 세포 내 투과 과정은 명확하게 알려져 있지 않으며 단백질 전달 도메인 (PTD)의 특성과 전달 물질의 종류, 세포형태에 따라 다양한 방법으로 전달된다고 알려져 있다. TCTP-PTD의 인간폐암세포 (A549)에서의 세포 내 투과 과정은 엔도사이토시스 관련 억제제인, 콜레스테롤 소멸억제제 (MCD), 엑틴중합변형 억제제 (cytochalasin D), clathrin-dependent 억제제 (chlorpromazine)과 다이나민 소멸억제제 (dynasore)를 통해 세포 내 투과 과정을 확인하였다. 또한 TCTP-PTD 세포 내 투과 기관이 어느 곳인지 확인하기 위해 lipid-raft fractionations과 subcellular fractionations 실험을 통해 밝혔다. 다양한 억제제 실험과 fractionations 실험을 통해 TCTP-PTD는 lipid-rafts/caveolae를 통해 세포 내로 들어가며 이때 다이나민과 엑틴의 관여를 발견하였으며, 세포질과 세포골격에 위치하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, TCTP-PTD를 처리한 세포에서 ER를 분리하여, TCTP-PTD가 ER을 경유한다는 것을 확인하였다. 따라서, TCTP-PTD가 lipid-raft/caveolae를 통해 세포 내로 들어간 후 caveosome에 의해 ER로 전달되고, 마지막으로 세포질로 나오게 됨을 다양한 생화학적 방법을 통해 밝혔다. TCTP-PTD가 항암제 전달체로 유용한지 확인하기 위해, proapoptotic 펩타이드인 KLA (KLAKLAKKLAKLAK)를 융합하여 세포 내로 전달하였다. KLA는 그 자체만으로 세포 내로 들어가서 세포를 죽일 수 없으나, 세포 내로 들어가면 미토콘드리아를 파괴하여 세포를 죽이는 특성을 가지고 있다. TCTP-PTD와 KLA를융합시켜 6종류의 암세포 (HeLa, AGS, ACHN, A549, HepG2, SK-Hep-1)에 처리하였다. Positive 비교 군으로 PTD 중 가장 잘 알려져 있는 TAT-PTD를 사용하였고, negative 비교 군으로 KLA 자체만을 처리하여 총 3개의 실험 군으로 실험하였다. KLA, TAT-KLA, TCTP-KLA의 IC50을 각각의 암세포에서 측정하였으며, TCTP-KLA는 6종류의 암세포에서 7-10 mol/L 이내의 농도로 측정되었다. 실제로 세포 내로 들어가 세포사멸을 일으키는지 알기 위해, 세포모양, 세포사멸단백질의 활성화 정도, 사멸세포의 수 등을 확인하였다. 또한 마우스에 인간폐암세포를 이종이식하였고, 이 모델에서 KLA, TAT-KLA, TCTP-KLA의 활성 정도를 bioluminescence 이미지와 종양 크기 그리고 H & E 염색을 통해 암세포가 줄어드는 상태를 확인하였다. 위 실험을 통해 TCTP-PTD는 단층상태의 세포에서는 TAT-PTD보다 효율이 떨어지지만, 동물모델인 in vivo에서는 기존의 PTD인 TAT-PTD보다 더 잘 투과하는 것을 확인하였다. 따라서, TCTP-PTD는 동물에서 더 효과적으로 전달할 수 있음을 제시하였다.