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Study on the potential signaling pathways of translationally controlled tumor protein involved in the vascular contractility

Title
Study on the potential signaling pathways of translationally controlled tumor protein involved in the vascular contractility
Authors
맹지혜
Issue Date
2013
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
이경림
Abstract
고혈압은 여러 합병증을 유발하여 사망률을 높이는 데 기여하는 주요 질병 중의 하나로, 이를 치료하기 위해 여러 약물들이 사용되고 있으나 다른 기전을 가진 약물의 병용요법에도 효과적인 혈압 조절에 어려움을 겪고 있다. 특히 고혈압의 발병 원인은 매우 복잡한 양상을 나타내며 여러 인자들이 복합적으로 작용하는 특성이 있어 고혈압을 유발하는 근본 원인 물질을 규명하기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있으나, 현재 뚜렷한 약물 타겟이나 치료제의 개발에 한계가 있다. 본 연구에서는 고혈압의 유발인자로 알려진 TCTP 분자가 어떠한 기전을 경유하여 혈관 수축력 조절 작용에 관여하는지 제시함으로써 현재 규명되지 않은 혈관 평활근에서 TCTP의 새로운 신호전달경로를 밝히고자 하였다. 본 연구에서는 TCTP가 고혈압의 발병에 관련하는 신호전달 경로 중 어느 경로를 조절하는지 확인하기 위하여 먼저 TCTP 단백질에 내재하고 있는 세포막투과도메인인 PTD (TCTP-PTD)를 이용하여 세포 내부로 TCTP 운반하기 위한 실험법을 연구하였다. 융합단백질의 제작에 있어서 TCTP-PTD의 위치와 수에 따른 투과도 영향을 파악하기 위해 여러 TCTP 융합단백질을 제작하여 세포투과도를 측정함으로써, TCTP 운반을 최적화하기 위한 PTD의 융합조건을 제시함으로써 PTD를 응용한 TCTP의 세포 내 과발현이 가능함을 제시하였다. 래트 혈관에서 추출한 일차배양 혈관세포에서 TCTP의 혈관 조절 기능 및 신호전달을 파악하기 위해 비교적 높은 효율로 장기간 발현 조절이 가능한 바이러스계를 이용한 유전자 전달 시스템을 이용하였다. TCTP의 발현을 조절한 후에 대표적인 고혈압 신호전달 경로인 RhoA, cGMP, COX-2 관련 신호전달 경로의 조절 여부를 확인하였다. 이 중에서 RhoA의 발현이 TCTP에 의해 영향을 받는 것으로 나타났으며, 이에 따라 하부 신호전달 분자인 MYPT-1 인산화를 통해 혈관세포의 수축을 유발하는 MLC의 인산화가 증가하는 상관성을 관찰하였다. TCTP를 과발현하는 형질전환마우스(TCTP-TG)와 TCTP 유전자 중 하나의 대립유전자가 제거된 마우스(TCTP+/-)에서 RhoA 발현, MLC 인산화 정도와 TCTP의 관련성을 invivo 수준에서 확인하였다. 한편 TCTP는 고혈당으로 자극된 혈관세포에서 그 발현이 증가되어 당뇨병성 고혈압에서 TCTP의 연관성을 유추할 수 있었다. 또한 TCTP가 혈관 이완에 관여하는 관련하는 신호전달 기작을 규명하기 위해, 인슐린에 의한 sodium pump 활성화에 관여할 것이라 여겨지는 TCTP의 인산화에 대해 연구하였다. 인슐린에 의한 sodium pump 활성 연구에서 많이 사용되는 293T 세포에서 인슐린에 의한 TCTP 인산화를 확인한 결과, TCTP의 Ser, Thr, Tyr 잔기 중 Ser 잔기에서만 인산화가 관찰되었다. TCTP Ser 잔기의 인산화는 인슐린 처리 10분에 뚜렷하게 나타났으며, HeLa 세포에서는 인슐린에 의한 TCTP Ser 잔기의 인산화가 관찰되지 않아 세포특이적으로 인슐린에 의한 인산화가 일어남을 알 수 있었다. 또한 인슐린에 의해 Ser 잔기가 인산화된 TCTP는 세포막 분획이 아닌 세포질 분획에서만 관찰되어, TCTP의 세포 내 위치가 인산화에 의해 변경될 수 있음을 암시하였다. TCTP의 인산화 자리를 파악하기 위하여 인산화를 예측할 수 있는 프로그램 분석을 바탕으로 TCTP의 Ser 잔기를 Ala으로 치환한 돌연변이를 발현시켜 인산화를 검색한 결과, TCTP의 9번 및 15번이 인슐린에 의해 인산화되는 자리로 나타났다. 따라서 인슐린에 의해 활성화되는 미지의 인산화 효소가 TCTP를 인산화하고, 인산화된 TCTP가 Na,K-ATPase에서 분리되면서 펌프 억제 활성이 소실됨으로써 인슐린에 의해 펌프 활성이 증가된다는 가설을 설정하였다. 이를 증명하기 위해 인슐린 의존적으로 활성화되어 TCTP를 인산화하는 인산화 효소를 규명하고, 인슐린에 의한 혈관 이완 반응에서 TCTP의 역할을 입증하는 후속 연구가 필요할 것이다. 이와 같이 TCTP는 Na,K-ATPase의 활성을 억제하고 RhoA의 발현을 유도할 뿐 아니라, 인슐린에 의한 펌프 활성화에 관여함으로써 혈관 수축 반응을 조절하는 것으로 보인다. 향후 후속 연구에서는 고혈당, 중금속 등의 인자에 의한 TCTP 조절 기전을 연구함으로써 본태성 고혈압뿐 아니라, 여러 형태의 고혈압을 치료하기 위한 약물 개발에서 TCTP를 신규한 타겟으로 제시할 수 있을 것이다.;Translationally controlled tumor protein (TCTP) has been identified as a suppressor for Na,K-ATPase by binding to its large cytoplasmic domain. Inhibition of Na,K-ATPase by TCTP in vasculature is known to be involved in the development of systemic hypertension, as shown in the TCTP-overexpressing transgenic mice (TCTP-TG). Functional relationship of vascular tone with TCTP implies that particular signalings are governed by TCTP in the vasculature to modulate the contractility, but the exact signalings are not elucidated. In searching for the experimental strategies for TCTP overexpression in primary cultured cells whose transfection efficiencies are generally low, here, the potential application of the protein transduction domain derived from TCTP (TCTP-PTD) for TCTP overexpression was preliminarily evaluated in human lung adenocarcinoma A549 cells. Transduction of several TCTP-PTD fusion proteins by conjugating a either single or tandem PTDs at the N-terminus, C-terminus, and both termini was compared to elucidate the optimal conjugation methodology for cellular entry. Fluorimetric analysis and western blotting results showed that TCTP-GFP fusion proteins containing one or two TCTP-PTDs at its N-terminus exhibited more efficient transduction than either the C-terminal TCTP-PTD or PTDs with both termini. This work elucidates the necessary requirements on the location or the number of PTD moieties in the TCTP molecule and reveals the feasibility of transduction of TCTP employing its TCTP–PTD by simple co-incubation of purified proteins with cells. To achieve highly stable expression of primary cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs), here, viral-mediated modulation of TCTP gene was applied in exploring the possible pathways of TCTP in the regulation of vascular tone. Western blot assay of the major components of RhoA-, cGMP-, and cyclooxygenase-2 (COX-2)-mediated pathways delineated its potential participation of RhoA-mediated pathway. In dissecting the RhoA pathway regulation confirmed that TCTP induces expression of RhoA and its downstream signalings thereby increasing the phosphorylation of myosin light chain (MLC) in primary cultured VSMCs, implying the possible contribution of RhoA pathway in TCTP-induced hypertension. Immunohistochemical analysis and western blotting of aortas from TCTP-TG displayed the elevated expression of RhoA as well as p-MLC whereas mice heterozygous for the deleted allele of TCTP (TCTP+/-) exhibited reduced signals of RhoA and p-MLC. In addition, potential role of TCTP in the regulation of sodium pump was also investigated under insulin stimulation. Insulin is an established activator of Na,K-ATPase, which is reported to be implicated in the relaxation of blood vessels, thereby lowering the blood pressure. In deciphering the mechanism of insulin-mediated Na,K-ATPase activation, post-translational modification of TCTP and resultant alteration in its subcellular localization were hypothesized. Upon insulin stimuli, TCTP was phosphorylated in its serine (Ser) residues in human embryonic kidney 293T cells. Phosphorylation of TCTP in its Ser residue was detected in the cytosolic fraction and showed maximum activity at 10 min in a cell type-specific manner. Computational prediction and assays using mutated constructs revealed that Ser-9 as well as Ser-15 is subjected for the phosphorylation by insulin. Further study to identify the possible kinase that is activated by insulin to phosphorylate the TCTP is underway. In conclusion, upregulation of TCTP activates the RhoA-mediated signaling pathway and TCTP can be further studied to relate the phosphorylation of TCTP and insulin-induced sodium pump activation. In addition, glucose-induced regulation of TCTP in VSMC indicates the potential pathophysiological role of TCTP in diabetic hypertension. Modulation of TCTP, on its expression and phosphorylation, therefore, can be further explored to suggest it as alternative modalities in the treatment of dysregulation in vascular contractility.
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