Mechanistic Study of Radioresistance Based on Bioinformatics

Abstract

Radiation therapy is commonly applied to patients with colon cancer owing to technical improvement in calculating dosages and confining local exposure. However, relapse after radiotherapy persists as a major concern for patients. Heterogeneous radiosensitivity both within cells of a tumor and among different patients hinders a permanent cure, because a small sub-population that survives from radiotherapy may eventually regrow. Consequently, strategies that target radioresistance are necessary to prevent the relapse. In chapter I, this study identified radioresistance genes based on clinical databases and bioinformatics including experimental results. Based on the genetic signature of patients with colon cancer, total 23 genes were identified as malignant genes that would exhibit radiation-responsiveness according to experimental databases. Through the validation processes, 3 genes including MDM2, JAK2, and PTPRC, commonly showed radiation-responsiveness in multiple experiment models, such as established cell lines, patient-derived primary colon cancer cells, and patient-derived tumor xenograft mouse models. The radioresistance potential of those genes were evidenced by increase of their expression in metastatic colon cancer and up-regulation upon radiation exposure. In functional validation processes, the knockdown of these genes sensitized cancer cells to radiation by reducing survival fraction after radiotherapy, respectively. In chapter II, experiments were conducted to elucidate the mechanism of radioresistance genes. It was firstly discovered that the expression of PTPRC was higher in colon cancer cells than in normal colon epithelial cells. The intrinsic expression level of PTPRC was negatively correlated with radiosensitivity in colon cancer cells, while the knock-down of PTPRC restored radiosensitivity. PTPRC augmented survival capacity and inhibited apoptosis under the treatment of radiation, however PTPRC had no effect on cellular proliferation, cell cycle, and migration in intact condition. Since survival capacity and anti-apoptotic potential are known to be enhanced in cancer stem cells (CSCs), the correlation of PTPRC with CSCs needed to be investigated. PTPRC was highly expressed in CD133+, LGR5+, standard CD44 (CD44s)+, and CD44v6+ CSCs. Moreover, the maintenance of CSCs was found to be dependent on PTPRC. In accordance with this data, the self-renewal activity of CSCs was aborted by the knock-down of PTPRC, and this phenomenon was accompanied with decrease of mRNA levels of pluripotent transcription factors, such as POU5F1 and SOX2, whereas a differentiation marker, ANPEP, was increased. In order to elucidate the molecular mechanism of PTPRC, molecules that may potentially interact with PTPRC were browsed by bioinformatics. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) visualized that PTPRC was linked to Wnt signaling. Therefore, the role of PTPRC on Wnt signaling cascade was examined. The knock-down of PTPRC disrupted the transcriptional activity of Wnt signaling and led to decrease of Wnt-target genes including LEF1, c-MYC, Cyclin D1, and Survivin. Since PTPRC abrogated the transcriptional activity of Wnt signaling, β-catenin, a transcription factor of Wnt signaling, was investigated. The knock-down of PTPRC increased the phosphorylation of β-catenin, whereas non-phosphorylated β-catenin was decreased. Consequently, the protein level of total β-catenin was reduced without affecting mRNA level. Moreover, when protein synthesis was blocked by cycloheximide, the knock-down of PTPRC fastened the disappearance of protein level of β-catenin, referring that PTPRC was involved in the degradation process of β-catenin rather than in its synthesis. Under the condition of blocked proteasomal degradation by MG132 treatment, the knock-down of PTPRC was determined to increase the level of ubiquitinated β-catenin. It was confirmed that the expression of β-catenin was excessively increased in colon cancer cells, accumulating in cytoplasm or nucleus region out of their original location, membrane. However, knock-down of PTPRC ameliorated this aberrant expression of β-catenin, remaining it intact at membrane level. Taken together, these evidences showed that the dephosphorylating activity of PTPRC inhibited the degradation of β-catenin, which resulted in Wnt signaling activation. Lastly, knock-down of β-catenin reduced survival capacity of cancer cells under the treatment of radiation by decreasing CD44v6+ CSC population, through which β-catenin was confirmed to participate in radioresistance and to have a positive regulation on CSCs. In the experimental mouse models, PTPRC was proved to have metastatic potential towards lungs and kidneys in accordance with clinical database. Moreover, in combination with radiation, the knock-down of PTPRC showed synergistic effect on the inhibition of primary tumor growth. Histopathological assays showed that inhibition of PTPRC reduced the population of proliferating cells expressing Ki67 and enhanced apoptosis proved by TUNEL assay. CD44v6+ CSC population in primary tissue was decreased by the knock-down of PTPRC along with reduction of aberrant accumulation of β-catenin. Therefore, this study showed that PTPRC/β-catenin axis served radioresistance through promoting maintenance of CSC and activating self-renewal activity of CSCs. In chapter III, the mechanisms behind CSC radioresistance were delineated based on comprehensive reviews of related literatures and recent patents on potential combinatory drugs. Tremendous studies have focused on the molecular mechanisms of CSCs that contribute to radioresistance. CSCs were proved to possess intrinsic and extrinsic resistance properties that prevent cellular damages by adapting to changes induced by radiation exposure, respectively. Among several resistant mechanisms of CSCs that have been elucidated, DNA repair and redox system directly decrease the radiation-induced DNA breaks and relieve cellular stress caused by reactive oxygen species (ROS), whereas altered metabolism and cellular signaling may indirectly help CSCs adapt to desolate microenvironment after radiation exposure. In order to overcome obstacles on the road to efficient cancer treatment, diverse therapeutic strategies using anti-sense oligonucleotides, small molecule inhibitors and antibodies have been tested, while some have exhibited the significant efficacy in improving current radiation therapy. Many agents that directly or indirectly sensitize CSCs have been developed, and some are currently being evaluated. This study suggests that the strategies targeting CSCs have potential to improve the efficacy of radiotherapy and proposes PTPRC/β-catenin axis as one of the radioresistance mechanisms promoting CSCs.;방사선치료기술의 발전으로 인해 정확한 조사선량 및 조사부위를 결정할 수 있게 되면서 오늘날 방사선치료는 정밀치료법으로써, 더 이상 선택이 아닌 필수로 인정되고 있다. 대장암에서 방사선치료는 주로 2기 또는 3기 환자를 대상으로 수술 전 또는 수술 후 시행되는데, 일반적으로 항암제 및 수술요법과 병행되며 환자의 완치율을 높이는데 효과가 있다. 드물지만 1기 환자에서도 절제수술 후 재발을 막기 위한 방사선치료를 시행하기도 하며, 4기 환자에서도 수술이 가능한 원격전이일 경우에 수술 후 보조요법으로 시행된다. 그러나 방사선 치료가 국소재발률을 낮추는 확률은 약 20-25 % 로, 여전히 재발이 방사선치료의 문제점으로 나타나고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 방사선 저항성을 억제하는 병용치료법을 개발하는 연구가 활발히 이루어지고 있으나 아직 뚜렷한 해결책이 없는 상황이다. 따라서 본 연구는 환자의 유전체 데이터베이스 및 방사선 관련 유전체 데이터베이스를 활용하여 방사선저항성 의심 유전자들을 발굴하였고, 방사선 저항성을 극복할 수 있는 치료타겟이 될 수 있는지 평가하였다. 원격전이대장암 환자에서 유의하게 증가하는 유전자 554 개와, 유의하게 감소하는 유전자 488 개 중, 데이터베이스에서 방사선에 의해 발현이 증가 또는 감소된다고 보고된 유전자는 각각 15개, 8개 이었다. 발굴한 방사선저항성 의심 유전자들이 실제로 방사선에 의해 발현이 변화하는지 세포단계에서 검증하였을 때, 통용되는 대장암 세포주와 환자유래 대장암 세포주 모두에서 발현이 변화하는 유전자는 PTPRC, JAK2, MDM2, 3가지 유전자였다. 이 유전자들은 원격전이대장암에서 발현이 유의하게 증가하였으며, 방사선이 조사된 세포주와, 특히 환자유래조직이 이식된 마우스모델에서도 발현이 증가하였다. 실제로 이들 유전자가 방사선저항성과 관련이 있는지 평가하기 위하여 shRNA를 이용하여 녹다운 세포주를 구축하여 방사선치료에 대한 감수성을 평가하였다. 이들 세가지 유전자를 각각 녹다운 하였을 때, 방사선 노출 후 세포의 생존률이 감소하였다. PTPRC는 T 세포 및 B 세포와 같은 면역세포에서 발현이 높다고 알려져 있으며, 이들의 활성화에 중요한 인자로 보고되어 왔으나, 대장암에서는 PTPRC의 암조직 내 발현이 환자의 예후와 음의 상관관계가 있다는 보고만 있을 뿐, 대장암세포에서의 발현 및 역할에 대해 보고가 없는 상황이었다. 본 연구에서 환자 조직과 세포주에서 PTPRC의 발현양상을 비교분석 하였을 때, PTPRC는 정상보다 암에서 발현이 증가되어있었다. 또한 PTPRC의 발현이 높은 암세포는 발현이 적은 암세포보다 방사선치료에 대한 민감성이 떨어져 있었으며, PTPRC 발현이 높은 환자유래 암세포주에서 PTPRC를 녹다운하면 방사선치료에 대한 민감성을 증가시킬 수 있었다. PTPRC 녹다운은 세포증식속도, 세포의 이동성, 세포주기에는 영향이 없었으나, 방사선치료 이후 암세포의 생존률 및 세포사멸저항성을 증가시켰다. 따라서 방사선저항성 특성을 가졌다고 보고된 암줄기세포와 PTPRC의 상관관계를 분석하였는데,. PTPRC는 부유배양을 통해 얻은 암줄기세포에서 일반암세포에서보다 발현률이 높았으며, 대장암줄기세포 마커를 기반으로 분리동정한 암줄기세포(CD133+, LGR5+, CD44s+, CD44v6+)에 특이적으로 발현이 증가되어있었다. 더욱이 PTPRC의 발현을 억제하는 녹다운 실험을 통해, PTPRC가 암줄기세포의 유지 및 자가재생능에 필수적인 요소라는 것을 알 수 있었다. PTPRC의 작용메커니즘을 규명하기 위하여, 생물정보학에 기반하여 PTPRC가 영향을 줄 수 있는 인자들을 가시화 하였는데, 윈트(Wnt)신호가 PTPRC와 관련되어 있어서, 실제로 PTPRC가 윈트신호전달경로에 어떠한 영향을 미치는지 연구하였다. 먼저 윈트신호의 전사활성에 미치는 영향을 보았을 때, PTPRC 녹다운은 윈트신호의 전사활성을 감소시켰고, 더 나아가 윈트신호의 타겟유전자의 발현을 감소시켰다. 따라서, 윈트신호의 전사인자로써 전사활성에 직접적인 영향을 주는 베타카테닌(β-catenin)에 PTPRC가 미치는 영향을 살펴보았는데, PTPRC를 녹다운하면 베터카테닌의 탈인산화 상태는 감소하고, 인산화는 증가하는데, 이때 베타카테닌의 mRNA양과는 무관하게 전체 베타카테닌의 단백질양은 감소하였다. 작용기전을 밝히기 위하여 cycloheximide 약물로 단백질 합성을 억제한 상황에서도 PTPRC 녹다운이 베타카테닌 단백질량의 감소를 촉진시키는 현상을 확인했고, 따라서 PTPRC는 베타카테닌의 합성단계보다는 분해에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 인산화된 베타카테닌은 유비퀴틴화를 통해 단백질 분해로 이어진다고 보고되어, PTPRC가 베타카테닌의 유비퀴틴화에 미치는 영향을 살펴보았다. MG132 약물로 프로테아좀(proteasome)의 단백질 분해를 억제한 상황에서 PTPRC 녹다운은 베타카테닌의 유비퀴틴화 정도를 증가시켰다. 위와 같은 결과를 바탕으로, PTPRC가 베타카테닌의 탈인산화를 유도하여 단백질의 분해를 억제하고 세포 내 축적 및 윈트신호의 활성에 기여한다는 사실을 알 수 있었다. 베타카테닌 녹다운을 활용한 실험을 통해, 베타카테닌이 방사선 치료 후 암세포의 생존률을 높이는데 기여하며, 암줄기세포의 유지에 중요하다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 PTPRC의 방사선 저항성 기전은 동물실험을 통해 재검증 하였는데, 방사선저항성 유전자 발굴 단계에서 PTPRC는 원격전이대장암에서 증가한 유전자였는데, 실제로 PTPRC를 녹다운한 세포주를 마우스의 꼬리정맥에 주입하였을 때, 폐전이 및 신장으로의 전이가 유의하게 감소하였다. 또한 PTPRC를 녹다운한 세포주를 마우스에 이식하였을 때, 방사선 조사에 의한 암크기 감소를 더 증폭시켰는데, PTPRC 녹다운한 암조직에서 암세포의 증식이 억제되었으며, 방사선에 의한 세포사멸은 증가되었다. 또한 PTPRC의 억제는 조직 내 과하게 축적된 베타카테닌을 감소시키면서 CD44v6+ 암줄기세포의 비율 또한 감소시켰다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, 유전체데이터베이스를 통해 발굴한 PTPRC는 베타카테닌의 탈인산화 및 세포 내 비정상적인 축적에 기여하여 윈트신호를 촉진시키고 암줄기세포의 유지 및 자가재생능을 촉진하여 방사선저항성을 유발하는 것으로 사료된다.