Enhanced Intracellular Delivery of Macromolecules via Melittin derivatives-induced Cellular trafficking

Abstract

This thesis aimed of development novel cell penetrating peptides (CPPs) for successful intracellular delivery of bioactive macromolecules, which is hindered by impenetrability of biomembranes and diversity of physicochemical features of proteins. A known membrane active peptide called melittin was used as template for the new CPPs. Truncated derivatives from melittin were prepared by sequential expurgation of three amino acids from the C-terminus in order to identify sequence regions that exhibit low toxicity and high intracellular drug delivery efficiency. Among its fragmented derivatives, Mel(1-14) shows highly efficient delivery of proteins into the cells regardless of their size and surface charge while maintaining the biological activities. The ability of Mel(1-14) to introduce protein drugs into cells were confirmed by two model protein drugs, ß -galactosidase and cytochrome C. The highest intracellular enzyme activity was observed in co-administration group of Mel(1-14) and ß-galactosidase, and a significant intracellular enzymatic activity was shown in various cell types. Cytochrome C-mediated apoptosis was significantly higher when treated with Mel(1-14) compared with TAT. Taken together, Mel(1-14) is a new concept CPP which could be utilized as a useful adjuvant for enhancement of intracellular drug delivery.;현재 가장 보편적으로 사용되고 있는 바이오의약품은 단클론항체, 성장인자, 효소, 호르몬 등의 단백질의약품이며, 생체 내 거대분자인 단백질의 높은 분자량 및 표면전하 특성 등의 요인으로 생체 막을 투과할 수 없으므로 대부분 세포 표면 혹은 세포 외의 질병 표적에 작용하는 약품으로 한정되어있다. 그러나, 질병의 원인이 되는 표적이 세포 내부에 있는 경우에는 단백질이 세포 내로 전달되는 과정이 반드시 필요하므로 흡수촉진물질 혹은 약물전달체 등을 적용할 수 있다. 세포 내로 약리적인 단백질을 전달하기 위하여 양이온성 고분자 복합체 및 리포좀(Liposome) 등 다양한 형태의 나노물질로 구성된 나노입자가 이용되어왔으나, 높은 세포독성 혹은 낮은 도입율, 복잡한 제조공정 등의 문제점이 대두되었다. 또한, 단백질 약물은 공통된 전하를 가지지 않으며, 온도, pH, 염의 조건 등 환경적 요인의 변화에 따라 쉽게 변성되므로 일부 약물전달체는 여러 단백질에 공통적으로 적용하기 어렵다는 점에서 사용에 제약이 따른다. 이러한 측면에서, 효과적인 세포 내 단백질 전달을 위한 연구의 일환으로 세포 간 혹은 세포 내에서 단백질을 생체막 내로 선택적으로 전달하는 데 이용되는 자연적 기전인 단백질투과도메인(Protein transduction domain, PTD) 혹은 막이동 시퀀스 (Membrane Translocating Sequence, MTS)로부터 유도된 세포투과성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CPP)에 대해 많은 연구가 수행되고 있다. 다양한 관련 연구를 통하여 CPP는 저분자 화합물은 물론 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 다양한 크기와 구조 및 생화학적 특성을 나타내는 물질을 세포 내로 전달 가능함이 밝혀진 바 있으며, 특히 세포 내 신호전달에 관여하는 단백질, 전사인자 및 효소 등의 전달을 통해 세포 내 기능 및 생리활성을 조절하고자 하는 시도가 된 바 있다. 또한, 기존에 존재하는 아미노산 서열을 기반으로 하여 보다 효과적으로 세포 내로 약물을 전달하는 새로운 CPP를 개발하는 연구 또한 진행되고 있다. 본 연구는 melittin이라는 막 활성 펩타이드를 기반으로 저독성 고효율의 CPP를 발굴하는 것을 목표로 하였다. Melittin은 봉독(bee venom)의 주성분 펩타이드로 생체막과의 독특한 상호작용을 통해 용혈 및 항균 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Melittin 고유의 막 상호작용 특성에 착안하여 C-말단부터 3개 아미노산을 순서적으로 절단하여 낮은 독성과 높은 세포 내 약물 전달효율을 특성하는 서열범위를 규명하고자 하였다. 그 결과, N-말단부터 14 개의 아미노산으로 구성된 Mel(1-14)가 낮은 세포독성은 물론, 기존에 가장 많이 연구되었던 CPP(TAT, MAP) 대비 우수한 세포내 약물 전달능을 나타내는 것을 확인하였다. Melittin의 C-말단을 부분적으로 절단한 결과, 절단부위가 길어질수록 세포독성이 현저히 감소함을 CCK-8 assay로 검증하였다. 형광미립자인 Quantum dot을 모델약물로 활용하여 melittin 절단 유도체의 세포 내 약물전달능을 유세포분석(Flow cytometry)을 통해 비교 평가한 결과, Mel(1-14)는 입자의 표면전하와 관계 없이 가장 우수한 세포전달율을 나타내었으며 이는 약물만을 처리했을 때의 도입효율과 비교하여 7~10배, 종래에 주로 연구되었던 TAT 및 MAP과 대비해서 2~3배 높은 수치이다. Mel(1-14)는 약물과의 복합체 형성과정 없이도 세포 내로 약물 전달이 가능하였으며, 이는 기존의 공유결합 컨쥬게이트 혹은 비공유결합 복합체 등을 형성해야만 약물도입이 가능하였던 CPP와 크게 구분되는 독특하며 유용한 특성이다. 상기 결과를 바탕으로 Mel(1-14)의 세포 내 단백질약물 도입능을 확인하는 실험으로 ß-galactosidase를 이용한 효소활성시험 및 및 Cytochrome C 도입을 통한 세포사멸율 분석을 수행하였다. 그 결과, Mel(1-14)와 ß-galactosidase를 공투여 한 군에서 가장 높은 세포 내 효소활성이 나타났으며, 다양한 세포군에서 유의한 세포 내 도입율을 보였다. 또한, Cytochrome C의 세포 내 도입에 의한 세포사멸효과는 기존에 잘 알려진 CPP인 TAT과 비교하여 Mel(1-14)를 처리했을 때 현저히 높게 나타났다. 본 연구결과를 바탕으로, Mel(1-14)는 신개념 CPP로서 세포 내에서의 단백질 기능의 연구 및 세포내 전달이 어려워 치료제로 개발되지 못했던 단백질 약물 및 다양한 물질을 세포 내로 전달하는데 보편적으로 활용 가능할 것으로 기대된다.