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Csk-Induced Phosphorylation of Src at Tyrosine 530 is Essential for H_(2)O_(2)-Mediated Suppression of ERK1/2 in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Title
Csk-Induced Phosphorylation of Src at Tyrosine 530 is Essential for H_(2)O_(2)-Mediated Suppression of ERK1/2 in Human Umbilical Vein Endothelial Cells
Other Titles
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) 에서 과산화수소에 의해 Src와 Csk를 경유하는 ERK 인산화의 특이적인 억제 현상 연구
Authors
전보경
Issue Date
2017
Department/Major
의학전문대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 의학전문대학원
Degree
Doctor
Advisors
최윤희
Abstract
Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are key signal transducers involved in various cellular events such as growth, proliferation, and differentiation. MAPK signaling pathways are usually activated by extracellular stimulants including reactive oxygen species. Previous studies have reported that extracellular H_(2)O_(2) leads to phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), one of the MAPKs in endothelial cells. The current study shows that H_(2)O_(2) suppressed ERK1/2 activation and phosphorylation at specific concentrations and times in human umbilical vein endothelial cells but not in immortalized mouse aortic endothelial or human astrocytoma cell line CRT-MG. Phosphorylation of other MAPK family members (i.e., p38 and JNK) was not suppressed by H_(2)O_(2). The decrease in ERK1/2 phosphorylation induced by H_(2)O_(2) was inversely correlated with the level of phosphorylation of Src tyrosine 530. Using siRNA, it was found that H_(2)O_(2)-induced suppression of ERK1/2 was dependent on Src and Csk. Translocation of Csk to the membrane was induced by H_(2)O_(2) treatment, and this translocation was reduced by knocking down Csk with siRNA. Physiological laminar flow abrogated, but oscillatory flow did not affect, the H_(2)O_(2)-induced suppression of ERK1/2 phosphorylation. In conclusion, H_(2)O_(2)-induced Csk translocation to the plasma membrane leads to phosphorylation of Src at the tyrosine 530 residue resulting in a reduction of ERK1/2 phosphorylation. Physiological laminar flow abrogates this effect of H_(2)O_(2) by inducing phosphorylation of Src tyrosine 419. These findings broaden our understanding of the acute defense mechanisms in the endothelium against oxidative stress.;Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) 는 다양한 세포에서 세포의 성장, 분열 및 분화와 같은 반응을 매개하는 중요한 신호전달물질이다. 혈관내피세포에서 MAPK는 활성산소종에 의한 산화 스트레스 및 혈류에 의한 기계적 스트레스 등 다양한 세포 외 자극에 의해 활성화되어 혈관 확장, 백혈구의 유출, 혈관 장벽의 손상 등을 일으키며 동맥경화증, 당뇨병, 허혈재관류 손상 등 다양한 혈관 질환의 발병 기전에 관여하고 있다. MAPK의 하위 구성원 중 하나인 Extracellular signal-Regulated Kinase (ERK) 는 일반적으로 과산화수소와 같은 활성산소종 자극에 의해 활성화되어 혈관세포의 투과성을 증가시키거나 세포자살을 막는 것으로 알려져 있다. 하지만 우리 연구에서는 처음으로 Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) 에서 특정한 농도의 과산화수소 처리에 의하여 유의한 ERK의 인산화 감소가 일어나는 것을 확인하였다. 이러한 ERK의 인산화 감소는 약 0.1 mM에서 1 mM 사이의 과산화수소 처리에 의해 일어났으며 0.5 mM의 과산화수소 처리 후 15분 뒤에 가장 현저하게 관찰되었다. MAPK의 다른 하위 구성원인 p38와 JNK는 과산화수소 처리에 의해 별다른 변화를 보이지 않았다. 한편 인간 성상세포종인 CRT-MG와 쥐 유래 동맥내피세포인 iMAEC 에서는 HUVEC에서와는 달리 기존의 보고들과 같은 과산화수소에 의한 ERK 인산화의 증가를 확인하였다. 과산화수소는 HUVEC에서 ERK 인산화의 감소와 함께 비-수용체 타이로신 인산화효소 중 하나인 Src의 419번 타이로신 잔기의 인산화 감소 및 530번 타이로신 잔기의 유의한 인산화 증가를 함께 일으킨다. siRNA를 사용하여 Src의 발현을 억제한 결과 과산화수소에 의한 ERK 인산화 억제의 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Src의 비활성화를 일으키는 530번 잔기를 인산화시켜 Src를 비활성화 시키는 인산화효소로 잘 알려진 Csk의 siRNA를 HUVEC에 형질주입 한 결과, 과산화수소에 의해 일어났던 ERK의 인산화 감소가 무효화되었다. 면역형광법 결과 0.5 mM의 과산화수소에 의해 세포막 쪽으로 Csk 이동하고 있음을 보았고, 비이온 계면활성제로 세포 용해물을 계면활성제에 용해되는 세포질 부분과 용해되지 않는 세포막 부분으로 나누었을 때 과산화수소 처리에 의해 세포막 부분의 Csk 양이 증가하는 것 또한 확인하였다. Csk siRNA 처리 시에는 이러한 세포막 부분으로의 Csk 이동이 관찰되지 않았고 이와 동시에 Src 530번 타이로신 잔기의 인산화 감소와 ERK 인산화 저하의 억제가 함께 관찰되었다. Csk의 이동과 Src의 비활성화를 매개로 일어나는 과산화수소에 의한 ERK 인산화의 억제는 혈관내피세포가 정상 환경에서 받고 있는 층흐름 전단응력을 함께 가할 때에는 일어나지 않았다. 하지만 진동 전단응력을 과산화수소와 함께 가할 때에는 대조군과 마찬가지로 ERK 인산화의 감소를 여전히 확인할 수 있었다. 결론적으로 정상적인 층흐름 전단응력이 존재하는 상태에서 ERK 인산화 감소가 전단응력에 의해 차폐되어 관찰되지 않지만 층흐름 전단응력이 교란되는 상황에서는 과산화수소 자극에 의해 Csk의 세포막 이동, Src 타이로신 530번 잔기의 인산화, Src의 비활성화가 일어나고 그 결과 ERK 인산화의 억제가 관찰된다. 이는 해로운 활성산소종 자극에 대한 혈관내피세포의 급성 방어 기제에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 될 것으로 보인다.
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