GATA1 Expression and JAK2, CALR, and MPL Mutation Profiles in BCR/ABL1–negative Myeloproliferative Neoplasms

Abstract

골수증식종양은 BCR/ABL1 양성 만성골수성백혈병과 BCR/ABL1 음성 골수증식종양으로 분류되며 BCR/ABL1 음성 골수증식종양에는 진성적혈구증가증, 본태혈소판증가증, 전섬유화단계 일차골수섬유증, 일차골수섬유증이 포함된다. BCR/ABL1 음성 골수증식종양의 아형은 질병 초기 병리조직학적 소견과 임상적 양상이 유사하기 때문에 정확한 아형의 구별은 논란의 대상이 되어왔는데, 특히 본태혈소판증가증과 전섬유화단계 일차골수섬유증의 구분이 어렵다. 현재 특정 진단 표지자가 없는 상황에서 BCR/ABL1 음성 골수증식종양의 정확한 아형 분류를 위한 형태학적 진단은 2016년 개정된 WHO 혈액종양 분류에서도 여전히 강조되고 있으나 형태학적 진단은 주관적인 검사라는 단점이 있다. 본 연구의 목적은 BCR/ABL1 음성 골수증식종양의 각 아형에서 GATA1 단백 발현의 특징 및 JAK2 V617F 정량검사를 포함한 JAK2, CALR, MPL 돌연변이 양상을 통해 BCR/ABL1 음성 골수증식종양의 정확한 아형 구분을 위한 보다 나은 방법을 제시하고자 한다. 본 연구는 1998년에서 2015년 사이에 이화여자대학교 목동병원에서 진단받은 123명의 환자를 대상으로 하였다. BCR/ABL1 음성 골수증식종양 환자군은 49명으로 진성적혈구증가증 9명, 본태혈소판증가증 17명, 전섬유화단계 일차골수섬유증 12명, 일차골수섬유증 11명이 포함되었다. 대조군은 74명 (BCR/ABL1 양성 만성골수성백혈병 9명, 양성혈액질환 15명, 골수증식종양 이외의 악성 혈액질환 50명)으로 하였다. JAK2, CALR, MPL 돌연변이 정성 검사와 JAK2 V617F 정량검사를 시행하였다. GATA1 면역조직화학염색은 포르말린 고정된 골수 검체에 GATA1 단클론항체를 이용하여 실시하였다. GATA1 점수는 GATA1 염색강도 점수와 GATA1 양성세포 백분율에 따른 점수를 곱하여 산정하였다. GATA1 점수가 6점 미만인 경우 병적인 것으로 판정하였다. JAK2 V617F 돌연변이 빈도는 진성적혈구증가증에서 본태혈소판증가증, 전섬유화단계 일차골수섬유증, 일차골수섬유증보다 유의하게 높았고, CALR, MPL 돌연변이 빈도는 각 아형에서 차이가 없었다. JAK2 V617F 대립인자 부하를 정량한 값은 본태혈소판증가증에서 진성적혈구증가증, 전섬유화단계 일차골수섬유증, 일차골수섬유증보다 유의하게 낮았다 (p<0.05). JAK2 V617F 대립인자 부하의 중간값은 진성적혈구증가증의 경우 76.2% (42.5-100.0), 본태혈소판증가증의 경우 29.8% (19.7-50.0), 전섬유화단계 일차골수섬유증의 경우 50.4% (31.6-93.0), 일차골수섬유증의 경우 97.7% (49.5-98.5)였다. GATA1 점수는 일차골수섬유증에서 진성적혈구증가증, 본태혈소판증가증, 전섬유화단계 일차골수섬유증, 대조군보다 유의하게 낮았다(p<0.05). 그러나 본태혈소판증가증과 전섬유화단계 일차골수섬유증 사이에서는 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 본태혈소판증가증 환자는 GATA1 점수가 고르지 않게 분포하였는데, 9점이상이 53%이었고, 6점 미만이24%이었다. 반면 전섬유화단계 일차골수섬유증 환자의 경우 92%의 환자가 GATA1 점수 9점 이상을 보였다. 진성적혈구증가증 환자의 추적 관찰 검체에서 GATA1 점수는 높게 유지되다가, 섬유화가 진행되면서 GATA1 발현이 감소되는 것이 관찰되었다. 일차골수섬유증 환자의 추적 관찰 검체에서는 GATA1 점수가 진단 시 1 또는 2점으로 낮았고, 추적 관찰 기간 중에도 심한 섬유화와 함께 계속 낮게 유지되었다. 진성적혈구증가증과 일차골수섬유증 환자의 GATA1 점수는 진성적혈구증가증 환자는 6점 미만이 없었던데 반해, 일차골수섬유증 환자는 6점 미만이 73%였다는 점에서 차이가 있었다. 진성적혈구증가증, 본태혈소판증가증, 전섬유화단계 일차골수섬유증 환자의 경우JAK2 V617F 대립인자 정량값이 50%를 초과하면서 GATA1 점수가 6점 미만인 환자는 없었던데 반해, 일차골수섬유증 환자의 약 1/3은 JAK2 V617F 대립인자 정량값이 50%를 초과하면서 GATA1 점수가 6점 미만이었다. GATA1 점수를 돌연변이 (JAK2, CALR, MPL 돌연변이 혹은 triple음성)유무와 (p=0.436) JAK2 V617F 대립인자 정량값에 따라(p=0.263) 비교하여 보았을 때 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다. 골수섬유화가 진행된 MF-2/3 군과 그렇지 않은 MF-0/1군으로 나누어 GATA1 점수를 비교하였을 때는 MF-2/3군에서 GATA1 점수가 유의하게 낮았다(p<0.001). 결론적으로 전섬유화단계 일차골수섬유증, 일차골수섬유증 환자의 JAK2 V617F 대립인자 정량값이 본태혈소판증가증에 비해 유의하게 높았으므로, BCR/ABL1 음성 골수증식종양 환자에서JAK2 V617F 돌연변이가 검출되면 대립인자 정량 검사를 하는 것이 중요할 것이다. 본 연구에서는 본태혈소판증가증과 전섬유화단계 일차골수섬유증 환자에서 GATA1 발현이 유의한 차이를 보이지는 않았지만, 진행된 골수섬유화를 보이는 환자들에서 GATA1 발현이 감소됨을 확인하였다. 따라서BCR/ABL1 음성 골수증식종양의 정확한 아형 구분을 위해서는 GATA1 발현의 평가와 분자유전학적 검사를 종합하여 해석하는 것이 가장 효과적인 방법이 될 것이다.;Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are classified into BCR/ABL1–positive chronic myeloid leukemia (CML), and BCR/ABL1–negative MPN which include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), prefibrotic PMF (prePMF), and primary myelofibrosis (PMF). However, subtyping of BCR/ABL1–negative MPN remains debatable, since the histopathological findings and clinical presentations are similar among subtypes of BCR/ABL1–negative MPN in the early course of disease. The differentiation between ET and prePMF has been a particular challenge. With no specific diagnostic marker currently available, the 2016 revision to WHO classification underscores the careful bone marrow morphologic examination for subtyping of BCR/ABL1–negative MPN, but it is a subjective assessment. The purpose of this study was to investigate the characteristics of GATA1 expression and JAK2, CALR, and MPL mutation profiles including JAK2 V617F allele burden in BCR/ABL1–negative MPNs for more accurate subtype classification. A total of 123 patients diagnosed at Ewha Womans University Mokdong Hospital between 1998 and 2015 were included in this study. The study group comprised 49 patients diagnosed with BCR/ABL1–negative MPN (9 PV, 17 ET, 12 prePMF, and 11 PMF), and the control groups included 74 patients (9 BCR/ABL1-positive chronic myeloid leukemia, 15 benign hematologic disease, 50 non-MPN hematologic malignancies). The assays of qualitative JAK2, CALR and MPL mutations and JAK2 V617F allele burden quantification were done according to protocols. The immunochemical assessment of GATA1 expression was performed using GATA1 rabbit monoclonal antibodies (Cell Signaling Technology, Danvers, USA) on the formalin-fixed and paraffin-embedded bone marrow biopsy samples. The GATA1 score was obtained by multiplying the intensity score by positive cell percentage score. The cutoff score of GATA1 was set at 6 based on the results of benign hematologic disease group, and the megakaryocytes with less than 6 of GATA1 score were considered as defective. The frequency of JAK2 V617F was significantly higher in PV than other groups, but there were no differences in the frequency of CALR or MPL mutation between ET, prePMF, and PMF. The allele burden of JAK2 V617F was significantly lower for ET than for PV, prePMF or PMF (p<0.05). The median allele burden of JAK2 V617F for PV patients was 76.2% (42.5-100.0); 29.8% (19.7-50.0) for ET patients, 50.4% (31.6-93.0) for prePMF patients and 97.7% (49.5-98.5) for the PMF patients. The GATA1 score was significantly lower in the PMF compared to PV, ET, or prePMF (p<0.05). No statistically significant difference, however, was found between the ET and prePMF groups (p>0.05). Patients with ET showed heterogeneous distribution of GATA1 score; 53% scored ≥9, while 24% scored <6, while the median GATA1 score of prePMF patients was 9 (6-12) with 92% of patients scored ≥9. In the PV patients, the GATA1 scores remained high during follow-up, but the GATA1 expression was decreased as the myelofibrosis progressed. In the PMF patients, the GATA1 scores were initially 1 or 2 at diagnosis, and remained the same low score during the follow-up with extensive fibrosis. In PV and PMF patients, GATA1 score was different in that none of PV patients scored <6 while 73% of PMF patients scored <6. In PV, ET and prePMF groups, no patient fall into the category of JAK2 burden >50%, and GATA1 score <6, while 33% of PMF patient showed JAK2 burden >50%, and GATA1 score <6. When the GATA1 scores were compared according to their mutation profiles (JAK2, CALR, MPL mutation and triple negative), or the allele burden of JAK2 V617F, the difference between groups was statistically not significance (p=0.436 and p=0.263). But the GATA1 score in the patients with progressed fibrosis (MF-2/3) was significantly lower than patients with mild or no fibrosis (MF-0/1) (p<0.001). This study showed that the allele burden of JAK2 V617F is much higher in PMF and prePMF group than in ET. Therefore it might be of importance to quantify the JAK2 V617F in the BCR/ABL1–negative MPN patients once JAK2 V617F mutation was detected. The GATA1 expression was significantly low in the patients with progressed myelofibrosis with statistical significance although the difference between ET and prePMF was not significant. The comprehensive interpretation with both GATA1 expression assessment and molecular assays would be the most effective approach for subtyping of BCR/ABL1-negative MPN.