Skeletal myogenic differentiation of human tonsil-derived mesenchymal stem cells

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) are capable of self-renewal and differentiation and are thus a valuable source for the replacement of diseased or damaged organs. Previously, it was reported that the tonsils can be an excellent reservoir of MSCs for the regeneration of skeletal muscle (SKM) damage. However, the mechanisms of differentiation from tonsil-derived MSCs (T-MSCs) to myocytes via myoblasts remain unclear. To clarify these mechanisms, gene expression profiles of T-MSCs during differentiation into myocytes were compared with human skeletal muscle cells (hSKMCs). Total RNA was extracted from T-MSCs, T-MSC-derived myoblasts and myocytes, and hSKMCs and was subjected to analysis using a microarray. Microarray analysis of the three phases of myogenic differentiation identified candidate genes associated with myogenic differentiation. The expression pattern of undifferentiated T-MSCs was distinguishable from the myogenic differentiated T-MSCs and hSKMCs. In particular, among the upregulated genes, autophagy related FNBP1L was selected, because autophagy is related to SKM metabolism and myogenesis. T-MSCs were differentiated into myoblasts and skeletal myocytes sequentially, as evidenced by increased expression of autophagy-related markers (including Beclin-1, LC3B, and Atg5) and decreased expression of Bcl2. Furthermore, it was reconfirmed that autophagy has an effect on the mechanism of skeletal myogenic differentiation derived from T-MSCs by treatment with 5-azacytidine and bafilomycin A1. These data suggest that the transcriptome of the T-MSC-derived myocytes is similar to that of hSKMCs, and that autophagy has an important role in the mechanism of myogenic differentiation of T-MSCs.;중간엽 줄기세포는 선천성 질환, 외상 또는 종양 제거로 인한 근육 조직의 결함으로 손상된 골격근(Skeletal muscle)의 재생을 촉진하는 데 치료용으로 사용될 수 있는 세포 재료 중 하나이다. 중간엽 줄기세포는 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제로부터 자유롭고, 제대혈, 골수, 말초혈액, 지방조직 등에서 얻을 수 있다. 특히 본 연구에서는 기존에 수술 후 버려지던 편도 조직에서 줄기세포를 추출, 배양하여 이를 이용해 골격근세포로의 분화를 연구하였다. 연구를 위하여 편도 유래 미분화 세포단계에서 근모세포 단계(myoblast), 근세포 단계(myocyte)로 분화를 진행하였고, 전능성 표지인자 (Pluripotent marker), 근위성 표지인자 (Myosatellite marker), 근육성 표지인자(Myogenic marker) 등을 이용해 근세포로의 분화를 확인하였다. 분화가 진행됨에 따라 전능성 표지인자와 근위성 표지인자 들의 발현양상은 감소되고 근육성 표지인자들의 발현양상은 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 근세포로 분화가 되었음을 알 수 있었고, 편도유래 근세포가 어떠한 기전을 통해 분화되는지를 알아보기 위해 분화 단계별로 마이크로어래이 (Microarray) 분석을 진행하였다. 마이크로어레이 분석을 통해 분화 단계별로 하향 조절된 (downregulation) 유전자와 상향 조절된 (upregulation) 유전자를 찾을 수 있었고, 상향 조절된 유전자들 중 FNBP1L (Formin binding protein 1-like) 라는 자가포식작용(autophagy)과 관련된 유전자를 특이적으로 찾을 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 FNBP1L을 포함한 근육분화의 표지자인 SVIL, SORT1, ANG와 자가포식표지자(autophagy marker)인 Beclin-1, ATG3, ATG5, ATG14 등을 Real-time PCR로 확인하고, 이중 자가포식 표지자는 웨스턴 블롯팅을 통해 단백질의 발현을 재확인하였다. 이를 통해 근세포로 분화하는 단계에서 자가포식작용이 중요한 역할을 할 것이라 예상하였고, 이를 규명하기 위해 자가포식작용 유도제인 5-azacytidine와 억제제인 bafilomycin A1를 처리하여 분화과정에 자가포식작용이 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다. 이러한 결과들을 통해 본 연구에서 편도유래줄기세포로부터 근세포로의 분화 가능성을 확인하였다. 또한 마이크로어레이 분석을 통해 편도유래 줄기세포로부터 분화된 근세포가 사람의 골격근세포와 유사한 기질을 획득한 것을 알게 되었고, 그 분화기전에 자가포식작용이 중요한 역할을 한다는 것도 알 수 있었다. 따라서 편도유래 줄기세포로부터 분화된 근세포는 선천성 질환, 외상 또는 종양 제거로 인한 근육 조직의 결함으로 손상된 골격근의 치료 방법 중 하나로 응용될 수 있을 것으로 생각되어진다.