Thermogels As Bioactive Agents Delivery System

Abstract

Temperature-sensitive hydrogel, that thermogel is a representative injectable formulation. Thermogel has a unique property of sol-to-gel transition when exposed to temperature and it can be easily mixing bioactive agent such as drugs and cells in liquid sol state. So these thermogel can be utilized in applications such as drug delivery depot, adhesion prevention, injectable tissue engineering, embolization, 3D cell culture, and wound dressing. In this thesis, focused on the bioactive agent delivery, 3D cell culture scaffold, and stem cell spheroid formation. At first, zwitterionic polymers have been investigated as surface coating materials due to their low protein adsorption properties, which reduce immunogenicity, biofouling, and bacterial adsorption of coated materials. Most zwitterionic polymers, reported so far, are based on (meth) acrylate polymers which can induce toxicity by residual monomers or amines produced by degradation. Here, we report a new zwitterionic polymer consisting of phosphorylcholine (PC) and biocompatible poly(propylene glycol) (PPG) as a new thermogelling material. The PC-PPG-PC polymer aqueous solution undergoes unique multiple sol-gel transitions as the temperature increases. A heat-induced unimer-to-micelle transition, changes in ionic interactions, and dehydration of PPG are involved in the sol-gel transitions. Based on the broad gel window and low protein adsorption properties, the PC-PPG-PC thermogel is proved for sustained delivery of protein drugs and stem cells over 1 week. Second, temperature sensitive nanogels prepared from ionic complexes of positively charged poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)-poly(L-alanine) (PEG-PK-PA) and negatively charged hyaluronic acid (HA) were investigated as intracellular delivery vehicles of a biomacromolecular drug of fluorescein isothiocyanate conjugated bovine serum albumin (FITC-BSA). By varying the weight ratio of the polymer to hyaluronic acid from 100/0 to 19/81, the zeta potential of the nanogel could be controlled from +47 mV (100/0), 0 mV (67/33), and -47 mV (35/65). In particular, the nanogels prepared from 67/33 exhibited 0 mV, and the size was reversibly changed from 220 nm at 20 °C to 160 nm at 37 °C with a narrow size distribution. The internalization of the FITC-BSA loaded nanogel was significantly affected by the zeta potential. In particular, the nanogel with zero zeta potential was very effective in internalizing the model drug. The cells treated with chlorpromazine significantly reduced the internalization efficiency, suggesting that clathrin mediated endocytosis is the main mechanism of the internalization of the nanogel. Third, a multiblock polymer (mP) with thermogelling and metal coordinating properties was prepared by pyridine-dicarboxylate (PDC) connected PEG-PPG-PEG triblock copolymers. About 5 triblock copolymers were connected per mP of which aqueous solutions underwent sol-to-gel transition as the temperature increased. Gel modulus at 37 °C could be controlled over 800 Pa to 8,000 Pa by adding Fe3+. As 0.5 and 1.0 equivalents of Fe3+ to PDC were added to mP aqueous solutions, PDC peaks at 8.0-8.6 ppm were collapsed in the 1H-NMR spectra (D2O), and the nano-assemblies of the mPs in the transmission electron microscopy images changed from fibers to spheres, and to ribbons, respectively, suggesting complex formation between Fe3+ and mP. Tonsil-derived mesenchymal stem cells (TMSCs) and HeLa cells were incorporated in the mP hydrogels by increasing the temperature of cell-suspended mP aqueous solutions to 37 °C. The TMSCs and HeLa cells were randomly embedded in the in situ-formed hydrogel, however, they aggregated to form a living cell spheroid at day 7. On the other hand, the spheroid formation was blocked in the Fe3+-incorporating mP thermogel. The high molecular weight of hydrophilic PEG, appropriate modulus in a range of 800-8,000 Pa, and cyto-friendly microenvironments contribute to the formation of the live cell spheroid in the gel. This thesis provides information not only on molecular design of the hydrogel for a single cell spheroid formation in situ but also on the preparation method of a promising injectable three dimensional cell culture matrix with a controllable gel modulus.;온도 민감성 하이드로겔, 즉 써모겔은 대표적인 주사 가능한 제형이다. 써모겔은 온도에 노출 시켰을 때, 졸-겔 전이가 일어나고, 낮은 온도의 액체(졸) 상태에서 약물, 세포와 같은 생물 활성제를 쉽게 섞을 수 있다. 이러한 써모겔은 약물 전달체, 유착방지제, 조직 공학, 3차원 세포 배양 지지체 및 상처 치료용 드레싱과 같이 다양한 응용이 가능하다. 본 논문에서는 써모겔을 이용한 생물 활성제 전달, 3차원 세포 배양 및 세포 타원체 형성에 초점을 맞추었다. 첫 번째, 양쪽 이온성 고분자는 낮은 단백질 흡착 특성으로 면역 반응을 줄이고, 생물 부착물 및 박테리아의 흡착을 방지할 수 있는 표면 코팅 물질로 연구되어왔다. 지금까지 보고된 대부분의 양쪽 이온성 고분자들은 (메타)아크릴레이트 폴리머를 기반으로 합성되었고, 이것은 잔류 단량체와 분해 시 독성을 띄는 아민이 생성된다. 본 논문에서는, 세포막의 성분인 포스포릴콜린(PC)과 생체적합한 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)을 이용한 새로운 양쪽 이온성 써모겔 고분자에 대해서 보고하고 있다. PC-PPG-PC 고분자 수용액은 온도 증가에 따라 다중의 졸-겔-졸-겔 전이를 겪는다. 열에 의한 단일체의 미셀로의 전환, 이온성 상호 작용과 PPG의 탈수 작용에 의해서 졸-겔 전이가 일어나게 된다. PC-PPG-PC 써모겔의 넓은 겔 윈도우와 낮은 단백질 흡착 특성을 바탕으로 단백질 의약품과 줄기 세포 전달 시스템을 연구하였고, 약 1주일간 서방형 방출이 확인되었다. 두 번째, 양전하의 폴리에틸린글리콜-폴리라이신-폴리알라닌(PEG-PK-PA) 삼중 공중합체와 음전하를 띄는 히알루론산을 이용하여 이온성 복합체를 제조하여 모델 약물인 FITC-BSA를 세포 내로 전달할 수 있는 온도 민감성 나노겔을 연구하였다. 상기 나노겔은 고분자와 히알루론산의 중량비를 변화 시킴으로써 제타 전위를 +47mV(100/0), 0mV(67/33), -47mV(35/65)로 조절 할 수 있다. 특히, 67/33의 비율로 0mV의 제타 전위차를 보이는 나노겔은 좁은 사이즈 분포를 보이며, 온도에 따라서 20 oC에서는 220nm, 37 oC에서는 160nm로 가역적인 크기 변화를 보였다. FITC-BSA를 로딩한 나노겔의 세포내 전달 정도는 제타 전위차에 의해 영향을 받았다. 특히, 제타 전위차가 0mV인 나노겔은 세포내로 모델 약물을 매우 효과적으로 전달하였다. 세포내 전달 메커니즘을 확인 하기 위한 실험에서 chlorpromazine(chlathrin-mediated endocytosis inhibitor)을 처리한 세포에서 세포내 약물 전달 효과가 현저하게 감소되었고, 이것은 나노겔의 세포내 약물 전달 메커니즘이 chlathrin-mediated endocytosis에 의한 것임을 보여준다. 세 번째, 써모겔과 금속 배위 특성을 갖는 다중 블록 고분자(mP)를 PEG-PPG-PEG 삼중 블록 공중합체와 피리딘 디카복실레이트(PDC)를 이용하여 제조하였다. 하나의 mP당 약 5개의 트리 블록 공중합체가 연결되었고, 이것의 수용액은 온도 증가에 따라 졸-겔 전이를 보였다. 37 oC에서의 겔 모듈러스는 800Pa에서 8000Pa로 Fe3+를 첨가하여 조절할 수 있었다. Fe3+를 0.5와 1.0 당량으로 mP 수용액에 넣어주면, 1H-NMR 스펙트라(in D2O)에서 8.0-8.6ppm의 PDC 피크가 붕괴되는 것을 볼 수 있었고, 투과전자 현미경(TEM)으로 관측한 mP와 Fe3+(0.5, 1.0) 복합체의 나노 어셈블리는 각각 구형과 리본 형태였다. 편도 유래 줄기 세포 (TMSCs)와 HeLa 세포를 포함시킨 mP 현탁액은 37oC로 온도를 증가시켜서 in situ mP 하이드로겔을 준비하였다. TMSCs와 HeLa 세포는 랜덤하게 하이드로겔에 포함 되었지만, 배양 후 7일째에 세포간의 응집이 일어나 살아있는 세포 타원체를 형성하였다. 한편, mP 써모겔에 Fe3+를 넣어주면 세포 타원체 형성을 방지할 수 있다. 친수성 PEG의 큰 분자량, 800-8000Pa 범위의 적절한 겔 모듈러스, 그리고 세포 친화적인 환경을 제공하는 하이드로겔은 살아 있는 세포의 타원체 형성에 기여한다. 이것은 단일세포 타원체 형성을 위한 하이드로겔의 분자 설계뿐만 아니라, 주사 가능한 3차원 세포 배양 매트릭스를 겔 모듈러스로 조절, 제조하는 방법에 대한 정보도 제공해준다.