TUDCA-Incorporated Thermogel as a One-Shot Injectable Tissue Engineering System for Hepatogenic Differentiation of Tonsil-Derived Mesenchymal Stem Cells

Abstract

As a one-shot injectable tissue engineering system, tonsil-derived mesenchymal stem cells (TMSCs), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), hepatocyte growth factor (HGF), and fibroblast growth factor 4 (FGF4) incorporating matrix was prepared in situ by increasing temperature of thermogelling poly(ethylene glycol)-b-poly(L-alanine) (PEG-L-PA: 2000-1150 Daltons) aqueous solution (14.0 wt.%) containing TMSCs and above factors. The sol-to-gel transition of the amphiphilic PEG-L-PA was observed in a range of 8-18 wt.% polymer aqueous solution, through the micelle aggregation. During the sol-to-gel transition, a partial decrease in β-sheet conformation was observed in the FTIR and CD spectra and collapses of PEG and L-PA peaks were observed in the 1H-NMR spectra. The gel modulus at 37 oC was controlled to be 1000 Pa by using 14.0 wt.% polymer aqueous solution for cell incorporation. TUDCA, HGF, and FGF4 were release over 21 days of cell culture. Initially spherical TMSCs protruded fibrous morphology in 14-21 days. Compared with the TMSCs cultured in thermogel, growth factor incorporating thermogel exhibited significantly higher expression of the hepatogenic biomarkers. The current PEG-L-PA thermogel proved to be better than commercially available cross-linked hyaluronic acid gel. In particular, TUDCA and growth factor incorporating PEG-L-PA thermogel not only exhibited most pronounced expression of the hepatogenic biomarkers at mRNA and protein levels but also demonstrated hepatogenic biofunctions such as ICG and LDL uptakes, ALB production, and urea secretion. Compared with HepG2 cells, about half of the hepatogenic biofunctions were realized from the 3D cultured TMSCs. The above data indicates that the 3D culture system of PEG-L-PA thermogels incorporating growth factors, differentiation factors, and stem cells can be a promising injectable tissue engineering system for liver tissue regeneration.;한번에 주입 가능한 조직 공학 시스템으로서 편도 유래 줄기세포의 간분화를 위해 디자인한 TUDCA를 포함한 온도민감성젤 본 연구에서는 한번에 주입 가능한 조직 공학 시스템으로서, 온도가 증가함에 따라 졸-젤 전이를 보이는 폴리(에틸렌 글라이콜)-L-폴리 알라닌 매트릭스 내에 간분화에 영향을 주는 성장 인자와 화합물을 실어 편도 유래 줄기 세포를 배양하였을 때 성장 및 분화를 관찰하였다. 폴리(에틸렌 글라이콜)-L-폴리 알라닌은 분자량이 2000달톤인 폴리(에틸렌 글라이콜)과 N-카복시 무수-L-알라닌을 고리 열림 중합 반응으로 합성하였고, 이렇게 합성된 이중블록 공중합체는 온도가 증가함에 따라 졸-젤 변이가 나타난다. 수용액상에서 고분자는 온도가 증가함에 따라 L-폴리 알라닌의 베타 시트 구조가 점차 감소하고 폴리(에틸렌 글라이콜)의 탈수화가 일어나며 졸-젤 전이가 나타난다. 합성한 폴리(에틸렌 글라이콜)-L-폴리 알라닌 온도민감성 수화젤 내에서 편도 유래 줄기 세포를 3차원으로 21일간 배양하여 간분화를 유도하였다. 쓸개즙의 한 종류로서, 일반적으로 간질환 치료제로 많이 쓰이는 TUDCA와 간분화에 영향을 주는 성장인자인 HGF와 FGF4를 온도민감성 수화젤 내에 함께 넣어준 경우가 그렇지 않은 경우에 비해 효과적으로 간분화에 영향을 주었다. 이를 간분화 지표와 단백질 발현뿐만 아니라 알부민 합성, 요소 생성, 인도시아닌그린 흡수, 지질단백질 흡수 등의 주요 간 기능 검사를 통해 확인하였다. 또, 상업적으로 이용 가능한 하이스템 스캐폴드의 경우 조직공학 시스템에 이용할 수 있다는 공통점은 있지만 간분화에 주는 영향이 크지 않았다. 본 연구에서 사용한 폴리(에틸렌 글라이콜)-L-폴리 알라닌 온도민감성 수화젤은 편도 유래 줄기 세포의 간분화에 적절한 환경을 제공해 줄 뿐만 아니라, 분화에 영향을 주는 분화인자들을 한번에 섞어 지속적으로 방출될 수 있는 매트릭스를 형성하였다. 이는 한번에 주입 가능한 조직공학 시스템으로 응용할 가능성을 보여주었다.