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Studies on the role of TCTP in EMT and autophagy

Title
Studies on the role of TCTP in EMT and autophagy
Authors
배성연
Issue Date
2016
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
이경림
Abstract
암은 현재 질병 중 사망률 1위로, 암을 정복하기 위한 타겟 발견을 위해 많은 연구가 진행이 되고 있다. 그 중 TCTP는 그 이름에서부터도 알 수 있듯이 발암과정에 밀접한 연관이 있음을 증명하는 연구가 많다. 우리 실험실에서는 그 동안 TCTP가 Na,K-ATPase를 억제함을 밝혔고, 그로 인해 유도되는 고혈압과 백내장의 기전을 연구한 바가 있다. 또한 TCTP가 Na,K-ATPase와 결합하여 Na,K-ATPase 신호전달계의 구성성분인 Src를 유리시키고 이 활성화된 Src가 EGFR을 활성화시켜서 발암과정에 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다. 한편, 최근 연구 결과 TCTP가 대사에 가장 중요한 신호전달물질 중 하나인 mTOR을 활성화시키는 것이 밝혀졌다. 초파리를 이용한 연구에서 TCTP는 TOR의 상위조절자인 dRheb과 결합하며 세포의 성장과 발달 과정에 중요한 역할을 하는 것이 규명되었고, 또한 이것이 포유류에서도 비슷한 결과가 도출되어 활발한 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 TCTP가 mTOR을 조절함으로써 암과 밀접한 관련이 있는 두 가지 현상, EMT와 오토파지의 조절자임을 밝혔다. 본 연구의 첫 번째 파트에서는 TCTP가 EMT 현상을 유도하여 암의 전이를 촉진하는 기전을 규명하였다. 최근 연구에서 새로운 EMT 현상의 지표로 Na,K-ATPase의 발현 감소가 제시되었기에 본 연구는 Na,K-ATPase를 억제하는 TCTP 또한 새로운 EMT 유도 단백질일 수 있을 것이라는 가설을 세우고 연구를 진행하였다. TCTP를 과발현시킨 돼지 근위세뇨관 상피세포인 LLC-PK1 세포를 사용하였고 여기서 상피세포지표는 감소하고 간질세포지표는 발현이 증가하는 전형적인 EMT 현상이 유도됨을 보았고 그 결과 세포의 이동성 및 침습성이 증가하는 것을 관찰하였다. 한편 TCTP를 감소시켰을 경우에는 이 모든 현상이 반대로 일어나는 것을 증명하여 TCTP가 EMT 현상의 유도제임을 증명하였다. TCTP가 세포의 이동성을 촉진하는 과정에서 mTORC2를 활성화시키며 그 하위조절자인 Akt/GSK3β 또한 활성화시켜 결과적으로 세포의 이동성을 증가하게 하는 β-catenin의 핵내이동을 증가시키는 것을 규명하였다. TCTP는 세포의 이동성뿐만 아니라 MMP-9을 증가시켜 세포의 침습성을 증가시키고, 궁극적으로 TCTP를 감소시킨 악성 흑색종의 폐 전이가 현저하게 감소하는 것을 규명하여, TCTP를 새로운 EMT 현상의 유도제로 규명하였고, 암의 전이를 억제할 수 있는 타겟임을 제시하였다. 본 연구의 두 번째 파트에서는 TCTP가 mTORC2를 활성화시킬 뿐 아니라 mTORC1을 활성화시키는 것에 주목을 하였다. mTORC1은 세포의 성장과 대사에 중요한 역할을 하기도 하지만 세포의 영양상태를 감지하여 AMPK와 상호작용하여 오토파지를 억제하는 것으로 잘 알려져 있다. TCTP가 mTORC1을 활성화시킨다는 기존 연구에 착안하여 본 연구에서는 오토파지를 억제할 것이라는 가설을 세우고 실험을 진행하였다. 그 결과 TCTP의 발현을 감소시키면 영양고갈이나 라파마이신 처리와 같이 오토파지의 전반적인 흐름을 증가시키는 것이 관찰 되었다. 또한 TCTP의 감소는 라파마이신 처리에 의해 감소되는 4E-BP1의 활성을 더욱 감소시켜 라파마이신에 의해 유도되는 오토파지를 더욱 강화시키는 것이 보였다. 본인은 TCTP가 조절하는 오토파지의 기전 역시 규명하고자 하였고 그 결과 TCTP의 발현감소에 의한 오토파지는 mTORC1/AMPK와 Beclin-1 상호작용체를 변화시키는 기전에 의한 것임을 제시하였다. 오토파지의 비정상적인 조절이 원인이 되는 다양한 질환에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 본 연구를 통해 다양한 질병의 원인이 되는 오토파지의 비정상적 조절을 TCTP를 통해 바로잡을 수 있는 가능성을 확인하였고 이에 TCTP를 오토파지 기저 질환의 타겟으로 사용할 수 있음을 제시하였다. 본 연구에서는 TCTP가 mTOR의 두 가지 복합체인 mTORC1과 mTORC2를 다 활성화시키며 mTORC1을 통해 세포의 성장 및 오토파지 등의 대사를, mTORC2를 통해 세포의 이동을 증가시키는 것을 관찰하여서 결론적으로 TCTP가 암화과정의 다방면에 작용하는 매우 효과적인 타겟임을 증명하였다.;Cancer is the most leading cause to death. Numerous studies are directed at cancer pathophysiology and development of the new drug target for cancer therapy. Translationally controlled tumor protein (TCTP), as the name suggests, has been massively studied to be involved in cancer pathophysiology. My group has focused on the inhibitory role of TCTP in the Na,K-ATPase activity which leads to related diseases such as systemic hypertension and cataract. Furthermore, my group revealed that TCTP contributes to breast cancer progression by binding to Na,K-ATPase, which leads to activate and release Src from Na,K-ATPase and then transactivate EGFR. In a recent study with Drosophila, TCTP revealed to play key roles in the cell growth, proliferation and development by providing GEF-like activity of dRheb, the upstream molecule of TOR. As similar results were reported in mammalian cells, the role of TCTP in mTOR regulation has been extensively studied. In this study, I demonstrated that TCTP modulates two phenomena, epithelial to mesenchymal transition (EMT) and autophagy, both of which are closely related to the cancer pathophysiology through mTOR pathway. In the first part of this study, I showed that TCTP promotes EMT process and thereby contributes to cancer metastasis. As mentioned above, TCTP inhibits Na,K-ATPase activity. Recently, downregulation of Na,K-ATPase expression was suggested as a new marker of EMT, a key step in tumor invasion, metastasis and fibrosis. I thereby tried to figure out the effect of TCTP on EMT process and found that overexpression of TCTP in a porcine renal proximal tubule cell line, LLC-PK1 induces EMT process. These results were reversed in TCTP-depleted cells confirming the role of TCTP as an EMT inducer. Moreover, I showed that TCTP overexpression promotes cell migration by activating mTORC2/Akt/ GSK3β/β-catenin, and invasiveness by activating MMP-9. I also performed the xenograft assay and proved that silencing of TCTP in malignant melanoma cells suppressed pulmonary metastasis by promoting MET process. Overall, I examined TCTP as a new EMT inducer and identified the underlying mechanism of TCTP in cancer progression and metastasis. In the second part of this study, I focused on the role of TCTP in regulating mTORC1 as well as mTORC2. mTORC1, a master controller of cell growth and protein synthesis, is also well known to inhibit autophagy as a nutrient sensor, competing with AMPK. Thus, I hypothesized that TCTP, a positive regulator of mTORC1, inhibits autophagy process. I found that knockdown of TCTP promotes overall autophagic flux like starvation and rapamycin, both are well known autophagy inducers. I also found that rapamycin-induced autophagy was potentiated by knockdown of TCTP through further dephosphorylating 4E-BP1. I also figured out the underlying mechanism of TCTP in autophagy; TCTP integrates major players of the autophagic pathway, mTORC1/AMPK and the Beclin-1 interactome. My studies suggested that TCTP may affect both mTORC1 and mTORC2 pathway; TCTP modulates cell cycle and autophagy by activating mTORC1 and changes cytoskeletal organization and cell motility through mTORC2. In the complex pathophysiology of cancer, I proposed that modulation of TCTP as an attractive target for cancer therapeutics.
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