폐 섬유화 모델에서 사멸세포 주입으로 유도되는 항염증 및 항섬유화 작용에 미치는 STAT6의 역할

Abstract

A previous study reported that single instillation of apoptotic cells after bleomycin treatment contributes to anti-inflammatory and anti-fibrotic responses through upregulation of peroxisome proliferator-avtivated receptor-γ (PPARγ) expression and subsequent activation in the course of bleomycin-induced lung injury in C57BL/6 mice. In the present study, we investigated the role of signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6) for upregulation of PPARγ expression and activation by apoptotic cell instillation. Intraperitoneal injections of AS1517499 (10mg/kg) one hour before apoptotic cell instillation into bleomycin-treated lung reduced mRNA and protein levels of PPARγ and its target molecules. Apoptotic cell instillation after bleomycin (BLM) treatment enhanced STAT6 phosphorylation over the course of BLM-induced lung injury. Co-administration of AS1517499 inhibited the increased STAT6 phosphorylation. Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) protein levels in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, known well as upregulators of STAT6, were reduced at 7 days and were not significantly different when compared to other experimental groups, such as of BLM or BLM+ApoJ at 14 days after bleomycin treatment. These data suggests that there is a novel pathway to induce STAT6 activity. STAT6 phosphorylation may be immediately increased by IL-4 and IL-13 pathways following apoptotic cell instillation. However, these pathway may not influence STAT6 phosphorylation 7 days after BLM treatment. In addition, the other mechanism may be involved in the STAT6 phosphorylation. We also found both gradual increase of high density lipoprotein (HDL) and ATP- binding cassette A1 (ABCA1), known as regulators of cholesterol homeostasis, following apoptotic instillation up to 14 days after bleomycin treatment. Also, the inhibition of STAT6 phosphorylation reverses anti-inflammatory and anti-fibrotic responses such as an increment of hepatocyte growth factor (HGF) expression and a reduction of hydroxyproline, a reduction of type 1 collagen α2, fibronectin and α-smooth muscle actin (α-SMA) as well as PPARγ expression and activation. These findings suggest that STAT6 mediates PPARγ expression and activation following apoptotic cell instillation over the course of bleomycin-induced lung injury and plays an important role in mediating anti-inflammatory and anti- fibrotic responses. Also, STAT6 phosphorylation may be induced by enhanced HDL and ABCA1 interaction following apoptotic cell instillation in bleomycin-induced lung injury;Bleomycin (BLM)을 투여한 폐섬유증 모델에서 사멸세포 주입에 의한 폐염증과 폐섬유화가 경감됨에 있어 peroxisome proliferator-avtivated receptor-γ (PPARγ)와 이와 관련된 타겟 인자들의 mRNA 및 protein의 활동도 증가가 보고된 바 있다. 이러한 이전의 연구를 토대로 본 실험에서는 사멸세포 주입 시 나타나는 PPARγ의 발현 및 활동도 증가, 항염증·항섬유화 작용에 있어 Signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6) 특이 억제제인 AS1517499를 사용하여 STAT6의 역할에 대하여 연구하고자 하였다. 먼저 폐섬유화 마우스 모델에서 2일 후 사멸세포와 AS1517499를 함께 투여하여 PPARγ의 발현을 비교하였다. 사멸세포 주입으로 증가된 PPARγ와 이와 관련된 타겟 인자들의 mRNA와 단백질 발현은 AS1517499 투여 시 유의성 있게 감소하였다. 더욱이 사멸세포 주입은 지속적으로 STAT6 인산화를 증가시켰으며, 이러한 STAT6 인산화 증가는 AS1517499 투여로 감소됨을 확인하였다. 그러나 STAT6의 조절 인자로 잘 알려져 있는 interleukin-4 (IL-4)와 interleukin-13 (IL-13)의 활동도는 사멸세포 주입 후 초기에 BLM 군과 비교 시 유의성은 없지만 아주 미약하게 증가되었으나 염증 후기에는 오히려 감소되었으며 섬유화 기간 동안 각 실험군에서 차이가 없는 기본 수준이었다. 이 결과는 사멸세포 주입 시 STAT6가 PPARγ를 유도하는 작용에 초기에는 아주 미약하게나마 IL-4와 IL-13와의 의존성이 가능하나, BLM 투여 7일 이후에는 IL-4 또는 IL-13 신호 관계없이 또 다른 새로운 기전이 존재한다는 가능성을 제시한다. High density lipoprotein (HDL)과 ATP-binding cassette A1 (ABCA1)의 상호작용으로 STAT6가 유도될 수 있다는 기존의 연구를 토대로 확인한 결과, 사멸세포 주입 후 14일까지 HDL과 ABCA1의 발현이 STAT6 인산화 양상과 유사하게 점진적으로 증가되었다. STAT6 억제제 투여는 PPARγ 신호 억제 뿐 아니라, 사멸세포로 유도되는 항염증 효과 (항염증 인자 및 호중구의 폐포 내 유입과 단백질 치수 감소), 항염증 및 항섬유화 인자 생성의 균형 조절 효과 transforming growth factor-β (TGF-β) 생성 억제와 hepatocyte growth factor (HGF) 생성 증진), 그리고 항섬유증 효과 (type 1 collagen α2, fibronectin, α-smooth muscle actin 및 hydroxyproline 생성 억제 효과)를 모두 다 반전시켰다. 본 연구 결과에서 사멸세포 투여로 STAT6 활성화 증가를 규명하였으며, 이러한 STAT6의 활성으로 인한 PPARγ의 발현 및 활성화가 이루어짐을 입증하였다. 또한 사멸세포 투여로 유도되는 항염증 및 항섬유증 작용에 STAT6의 활성화가 중요한 매개 역할을 하고 있음을 규명하였다.