The role of fractalkine/CX3CR1 in diabetic kidney disease

Abstract

Diabetic kidney disease (DKD) is the main cause of end-stage renal diseases. The major pathologic feature of DKD is glomerular and tubulointerstitial fibrosis. Increasing evidences have suggested that renal inflammation plays an important role for the development and progression of DKD. Fractalkine (FKN, CX3CL1) functions not only as a chemoattractant but also as an adhesion molecule and plays a role in the recruitment of macrophages into the kidney through binding to its receptor CX3CR1. The present study examined the role of FKN/CX3CR1 in extracellular matrix (ECM) accumulation and monocyte recruitment in diabetic kidneys. In part I, CX3CR1 knock-out (KO) mice and siRNA for FKN or CX3CR1 were utilized in order to determine the role of FKN/CX3CR1 in ECM accumulation in DKD. Streptozotocin (STZ; 50 mg/kg/day) was intraperitoneally administered for 5 consecutive days in male C57BL/6J wild type and CX3CR1 KO mice. At 12 weeks after the induction of diabetes, equivalent hyperglycemia was observed in diabetic WT and CX3CR1 KO mice. However, parameters of DKD including increased blood pressure, glomerular volume, fractional mesangial area, and accumulation of renal fibronectin and collagen were much less severe in diabetic CX3CR1 KO mice than diabetic WT mice. In MMCs, 30 mM high D-glucose (HG), 100 μM oleic acid (OA), and 10 ng/ml of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) upregulated FKN and CX3CR1 mRNA and protein expression along with ECM expression, which was significantly attenuated by 50 nM of FKN or CX3CR1 siRNA. More importantly, FKN itself increased ECM synthesis in MMCs, and CX3CR1 siRNA abrogated FKN-induced ECM synthesis. Neutralizing TGF-β antibody inhibited FKN/CX3CR1 expression in diabetic condition and decreased FKN-induced ECM accumulation. In part II, I evaluated whether FKN functions as an inflammatory factor through monocyte infiltration in diabetic conditions. F4/80 immunostaining for macrophage was attenuated in diabetic CX3CR1 KO mice compared to diabetic WT mice. Monocyte/mesangial cell binding estimated by Calcein-AM-labeled WEHI cells and adhesion molecules including ICAM-1 and VCAM-1 were enhanced in MMCs cultured under diabetic conditions (HG, OA, and TGF-β1). Monocyte binding to MMCs and ICAM-1/VCAM-1 expression in MMCs were increased when FKN was treated in MMCs. In addition, monocyte/mesangial cell binding and FKN expression in MMCs cultured under diabetic conditions were effectively inhibited by N-acetylcystein (NAC). On the other hand, hydrogen peroxide directly increased monocyte adhesion and FKN expression in MMCs. These results demonstrated that FKN/CX3CR1 may play important roles in DKD through regulating ECM accumulation and macrophage adhesion to mesangial cells, and suggest that FKN/CX3CR1 system may become an effective therapeutic target for DKD. ;당뇨병성 신증은 말기 신부전증을 유발하는 가장 흔한 원인 질환이며 대표적인 병리학적 특징은 사구체와 세뇨관 간질의 섬유화이다. 최근 연구에서 신장 내 염증반응이 당뇨병성 신증의 발달과 진행에 있어서 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다. Fractalkine (FKN, CX3CL1)은 화학주성인자(chemoattractant) 형태와 접촉분자(adhesion molecule) 형태의 두 가지 유형으로 존재하며 유일한 수용체인 CX3CR1과 결합하여 신장 내로 대식세포를 침윤시키는 역할을 한다. 본 연구에서는 FKN/CX3CR1이 당뇨 신장에서 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 축적과 단핵구(monocyte) 침윤에 관여하는지 알아보고자 한다. 첫 번째 실험에서는 CX3CR1 결핍(CX3CR1 KO) 생쥐와 FKN /CX3CR1 발현을 억제했을 때 당뇨병성 신증에 의한 ECM 단백 생산에 미치는 영향을 관찰하였다. 제1형 당뇨모델로서 streptozotocin (STZ; 50 mg/kg/day)을 C57BL/6J와 CX3CR1 KO생쥐에 5일간 복강 내 투여하였다. 당뇨 유발 후 12주 동안 야생형(wild type: WT)과 CX3CR1 KO 생쥐 간의 혈당 차이는 없었다. 그러나 당뇨병성 신증의 지표인 고혈압, 사구체 비대, 신장 내 ECM 축적은 당뇨병을 유도한 CX3CR1 KO 생쥐가 WT생쥐에 비하여 유의하게 감소하였다. 사구체혈관간 세포(mesangial cell: MMC)에 30 mM 고포도당(high D-glucose: HG), 100 μM 고지질(oleic acid: OA) 그리고 10 ng/ml 전환성장인자(transforming growth factor-β1: TGF-β1)를 처리하면 FKN/CX3CR1 발현과 더불어 ECM 축적을 증가시키고, 이러한 증가는FKN이나CX3CR1 siRNA 50 nM 농도에서 유의성 있게 감소시켰다. 무엇보다도 FKN 자체만으로 MMC 내에 ECM 생성을 증가시키고, 수용체를 억제 했을 시에는 ECM 합성이 억제되었다. TGF-β 중화항체(neutralizing antibody)를 처리하면 당뇨 환경에서 증가한 FKN/CX3CR1 발현을 감소시키고 FKN 에의한 ECM 축적도 감소시켰다. 두 번째 실험에서는 염증성 인자인 FKN이 당뇨 환경에서 MMC 내로 단핵구 침윤을 하는지 확인하였다. F4/80 면역염색(immunostaining)을 했을 시 당뇨 WT생쥐에 비해 CX3CR1KO생쥐에서 대식세포 침윤 정도가 감소되었다. 그리고 당뇨 환경일 때, 단핵구와 MMC간의 상호 작용과 접촉분자들의 생성이 증가하였다. 이러한 증가는 FKN을 단독으로 MMC에 처리하여도 접촉 분자의 증가를 나타내었고 항산화제(N-acetylcystein: NAC)에 의하여 억제되었다. 반면에 과산화수소를 처리하였을 때 단핵구와 MMC의 상호작용과 FKN 발현을 증가시켰다. 이와 같은 결과를 바탕으로 FKN/CX3CR1을 통한 ECM 축적과 단핵구와 MMC의 상호작용이 당뇨병성 신증 발달에 중요한 역할을 한다고 생각 할 수 있으며 FKN/CX3CR1이 당뇨병성 신증의 효과적인 치료 접근을 가능케 한다고 할 수 있다.