Neuroprotective and Antiepileptic Effects of Oleamide as a Novel Calpain Inhibitor against Kainc Acid-Induced Excitotoxicity and Behavioral Epilepsy

Abstract

Oleamide known as a sleep-inducing fatty acid amide compound has been shown to produce wide ranges of neuropharmacological actions upon different neurochemical systems. However, effects of oleamide on the brain damage are scarcely studied, and the molecular mechanisms and site of its action remain elusive. Kainic acid (KA) is a neurotoxin that is known to produce an epileptic animal model mimicking human temporal lobe epilepsy and induce excitotoxicity occurring in numerous neurodegenerative disorders. In this study, we examined the effects of oleamide on KA-induced excitotoxic brain damage accompanying behavioral seizure activity and neuronal cell death, especially leaded by calpain activity-related cellular mechanisms. The KA-induced epileptic rats were produced by an intrastriatal injection of KA (5 nmol). Oral administration of oleamide (0.5, 2 and 10 mg/kg suspended in 0.2% methyl cellulose) 30 min before the KA injection, followed by repeats daily for next 4 days after the surgery produced the dose-dependent inhibition of the KA-induced behavioral seizure activity. Oleamide blocked the KA-induced calpain-mediated cleavage of cyclin-dependent kinase-5(cdk5) coactivator (p35) and collapsin response-mediated protein (CRMP)-2, and dose-dependently reversed the KA-caused reduction of expression levels of an endogenous calpain inhibitory protein, calpastatin, and a synaptic activity marker protein, synapsin 2, in striatal brain tissues dissected from the epileptic rats. In addition, neuroprotective effects of oleamide against the disrupted neuronal integrity resulting from the KA-induced excitotoxicity were demonstrated by staining of striatal tissue sections with cresyl violet, hematoxylin/eosin (H & E) and fluoro-Jade B (FJB). I hypothesized that the calpain inhibition (direct and/or indirect) by oleamide is an unveiled novel mechanism for neuroprotection, and this was demonstrated through in vitro calpain assays in brain tissue and calpain overexpressed neuronal cell system. These findings together suggest that oleamide has protective effects against excitotoxicity-caused neuronal death and behavioral seizure, partly via its own calpain inhibitory activity.;Oleamide는 수면을 유도하는 지방산아마이드 (fatty acid amide)로 광범위한 신경 약리학적 작용을 보이며 신경화학 시스템과는 많은 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 뇌 손상에서의 oleamide의 효과는 거의 연구되지 않았고, 분자적 메커니즘과 작용 사이트는 아직까지 이해하기 어려운 채로 남아 있다. Kainic acid (KA)는 흥분세포독성 (excitotoxicity)을 일으켜 퇴행성신경질환(neurodegenerative disorders)을 유도하는 물질로, 사람의 측두엽간질 (temporal lobe epilepsy)을 모방 할 수 있는 동물 모델을 만들 수 있다. 이 연구는, KA에 의해 흥분세포독성이 일어나 뇌 손상이 야기됨에 따라 나타나는 경련행동과 특히, calpain 활성에 연관하여 세포의 메커니즘으로부터 초래되는 신경세포의 사멸에 있어서 oleamide가 나타내는 효과에 대하여 실험하였다. 먼저, 경련 쥐 모델은 뇌의 선조체에 (intrastriatal) 정위적 수술 (stereotactic surgery)을 통해 KA 5 nmol을 주입하여 만들었다. Oleamide는 0.5, 2 그리고 10 mg/kg의 용량으로 0.2% 메틸셀룰로오즈 (0.2% methyl cellulose)에 현탁하여 KA 주입 30분 전에 경구로 투여하였으며, 수술한 날부터 4일간 용량 별로 매일 경구투여를 반복해주었다. KA에 의한 경련행동의 정도는 3시간 동안 관찰되었으며, KA 단독 투여군에 비해 oleamide를 함께 투여한 군에서 용량 의존적으로 약하게 나타났다. 또한, 경련 쥐를 해부하여 얻은 뇌의 선조체 조직에서 calpain 매개로 나타나는 calpain 기질 단백질, cyclin-dependent kinase-5 (cdk5)와 collapsin response-mediated protein (CRMP)-2을 확인하였다. 그 결과, oleamide는 KA로 유도되는 Cdk5와 CRMP-2의 분열을 막았으며, 추가적으로 확인한, 내인적인 calpain 억제제인 calpastatin과 시냅스 활성의 지표인 synapsin 2의 레벨을 용량의존적으로 control 수준까지 회복 시켰다. 이와 더불어, 본 연구에서는 KA로 유도된 흥분성세포독성의 결과로 신경세포의 괴사에 대한 oleamide의 보호효과를 선조체 조직 섹션으로부터 cresyl violet, hematoxylin & eosin (H & E) and fluoro-jade B의 염색을 통해 관찰하였다. 그 결과, KA에 의해 유발된 뇌 선조체 신경괴사는 oleamide에 의해 차단되는 경향이 관찰됨으로써 oleamide가 뇌신경 보호작용을 가지는 것으로 입증 되었다. 이 연구의 가설은 뇌 신경 보호작용에 대한 oleamide의 밝혀지지 않은 새로운 메커니즘으로 calpain을 직/간접적으로 억제한다는 것이다. 따라서, calpain을 과발현 시킨 세포시스템과 동물의 선조체 조직에서 in vitro calpain 분석을 통하여 oleamide가 calpain의 활성을 상당히 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, oleamide는 KA에 의한 calpain 매개 신경조직의 손상과 사멸 메커니즘에 대해 보호 효과를 갖는데, 이는 calpain의 활성을 직접적으로 저해함으로써 항 경련효과와 신경보호효과를 나타낼 수 있다는 가능성의 결과를 얻었다. 결론적으로 이 연구는 oleamide가 새로운 calpain 저해제로 잠재력을 가지고 있음을 제안하는 바이다.