Preventive effects of natural naphthoquinones on Aβ oligomerization and oxidative stress- or Aβ-induced neurotoxicity in hippocampal cells and slice cultures

Abstract

Beta-amyloid (Aβ), which is generated via sequential cleavage of amyloid precursor protein (APP) by β-secretase and γ-secretase, is a key pathogenic peptide for Alzheimer’s disease (AD). The hallmark of AD is the self-aggregation of Aβ monomers into oligomeric and fibrillar forms. Recently, many reports suggested that soluble Aβ oligomers induce neurotoxicity through oxidative stress or receptor binding. On the other hand, soluble APPα (sAPPα) produced when APP is cleaved by α-secretase, is well-known not only to preclude Aβ formation, but also to activate pro-survival pathway. Thus drugs capable of preventing Aβ oligomerization, reversing oxidative stress-induced neurotoxicity, modulating toxic signal transduction, or increasing neurotrophic factor such as sAPPα would have beneficial therapeutic potential for AD. In the present study, thirty herbal compounds were first screened for their capability of blocking Aβ oligomerization using an atomic force microscopy (AFM) analysis, and among them, two active isomeric naphthalene derivatives, (+)-eleutherin and (−)-isoeleutherin, both derived from Eleutherine americana, were selected for further study. Previous reports have shown that the two natural compounds have anti-bacterial, anti-cancer and anti-inflammatory functions; however, no studies about their effects on neuronal systems were yet reported. The purpose of this study was to investigate whether (+)-eleutherin or (−)-isoeleutherin possess neuroprotective effects against oxidative injury or Aβ toxicity in murine hippocampal cells or organotypic hippocampal slice culture (OHSC). The inhibitory effects of the compounds on Aβ oligomerization were confirmed by statistical analysis of AFM. With co-incubation of (+)-eleutherin or (−)-isoeleutherin, less Aβ oligomers were observed and z-volume of particles were reduced compared to control. Thioflavin T assay provided further evidence for significant dose-dependent inhibitory effects of the naphthoquinoids on Aβ oligomerization. In order to investigate whether the compounds have effects on neuroprotective sAPPα release, the levels of sAPPα in culture media from mouse hippocampal HT22 cells were immunoblotted. Enhanced level of sAPPα was observed in the compound (0.5-30 μM)-treated cells for 24 hours, which implies the possibility for neuroprotective properties of the compounds. Next, it was examined whether (+)-eleutherin and (−)-isoeleutherin produce protective effects on oxidative stress-induced neurotoxicities in HT22 cells. Pre-treatment of the neuronal cells with the compounds (0.1-10 μM) significantly protected against the neuronal cell death induced by exposure to glutamate, H2O2, or rotenone for 24 hours. It was also found that pre-treatment of HT22 cells with the compounds (0.1-1 μM) for an hour recovered the level of the sAPPα release dramatically reduced by H2O2, indicated that sAPPα release enhancement is involved in the neuroprotective properties of the compounds. The two naphthoquinoids (0.5-5 μM) also reduced the level of glutamate-induced production of reactive oxygen species produced by glutamate. As oxidative stress has been closely linked with endoplasmic reticulum (ER) stress and mitochondrial dysfunction, levels of related proteins were investigated whether their altered expression is restored by (+)-eleutherin. Immunoglobulin binding protein / glucose regulated protein 78 (BiP/GRP78), an ER stress marker, and growth arrest and DNA damage 153 / C/EBP homologous protein (GADD153/CHOP), a pro-apoptotic factor which is induced by ER stress, were increased by glutamate toxicity, but normalized with pre-treatment of (+)-eleutherin in HT22 cells. No changes in Bcl-2 expression were observed after glutamate treatment. However, the expression of Bax, a pro-apoptotic factor related with mitochondria, was increased upon 24 hours exposure of glutamate, whereas an hour pre-exposed cells with (+)-eleutherin recovered the level of Bax in HT22 cells. Finally, the neuroprotective effects of (+)-eleutherin was examined in OHSC under potentiated Aβ toxicity with N-methyl D-aspartate (NMDA). The fluorescence of propidium iodide (PI), which is uptaken by damaged cells, was increased in CA1 by Aβ co-treated with NMDA; however, pre-treatment of (+)-eleutherin (1, 10 μM) significantly reduced PI uptake. Additionally, the disturbed expression of BiP/GRP78, GADD153/CHOP, Bcl-2 and Bax was restored by (+)-eleutherin in OHSC. Therefore, it can be inferred from these results that (+)-eleutherin exerts protective role in Aβ toxicity, assumed to mediate via NMDA receptor by attenuating ER stress and mitochondrial dysfunction. Taken together, results obtained from cells and slice cultures demonstrated that both (+)-eleutherin and (−)-isoeleutherin produced significant neuroprotective effects against oxidative injury and Aβ toxicity, possibly through enhancing sAPPα release or limiting ER stress and mitochondrial dysfunction. Furthermore, their anti-amyloidogenic properties confirmed in cell-free system could be explained as one of the mechanisms of neutralizaing Aβ oligomer toxicity. Therefore the naturally-occurred naphthoquinones are suggested as novel candidate drugs for AD treatment. In vivo therapeutic effects of the naphthoquinones in AD animal models remain to be further studied.;베타 아밀로이드 (beta-amyloid: Aβ)는 아밀로이드 전구 단백질 (amyloid precursor protein: APP)이 베타 분비효소 (β-secretase)와 감마 분비효소 (γ-secretase)에 의해 차례로 잘려나가 생성되는 단백질로서 알츠하이머 질환 (Alzheimer’s disease: AD)의 발병기전에 있어서 중요한 역할을 담당한다. AD의 주요 병리학적 특징은 Aβ 단량체 (monomer)가 스스로 뭉쳐 저중합체 (oligomer) 형태와 섬유 (fibril) 형태로 존재로 관찰된다. 최근 들어 많은 연구결과들이 가용성의 Aβ oligomer가 산화적 스트레스나 수용체에 직접 결합함으로써 신경독성을 일으킨다고 주장한다. 다른 한편으로, APP가 알파 분비효소 (α-secretase)에 의해 잘리면 가용성 아밀로이드 전구 단백질 알파 (sAPPα)가 생성되는데, 이로 인해 Aβ의 생성이 저해될 뿐만 아니라 세포의 생존 경로가 활성화 됨이 알려져 있다. 그러므로 Aβ의 oligomer화 (Aβ oligomerization)를 막거나, 산화적 스트레스로 인한 신경독성을 중화시키거나, 독성 신호전달 기전을 조절하거나, sAPPα와 같은 신경영양성 인자를 늘리는 것이 AD의 유익한 치료학적 목표가 될 수 있다. 현 연구에서는, 우선 서른 개의 천연물 유래 물질들이 Aβ oligomerization에 어떤 영향을 미치는지 원자력 현미경 (atomic force microscopy: AFM) 을 이용한 분석으로 가려졌으며, 그 중 두 개의 naphthoquinone 유도체의 이성질체들이 후속 연구 대상으로 선정되었다. Eleutherine americana에서 추출된 (+)-eleutherin과 (−)-isoeleutherin은 항박테리아, 항암, 그리고 항염작용은 잘 알려져 왔지만 중추신경계 시스템에서의 효과는 한번도 보고된 적이 없었다. 이 연구의 목적은 (+)-eleutherin 혹은 (−)-isoeleutherin이 AD 치료제로서 가능성이 있는지 시험해 보고자 함이다. 첫째로, AFM을 이용한 통계적인 분석을 통해 두 물질이 Aβ oligomerization을 확실히 저해하는지 확인되었다. (+)-eleutherin이나 (−)-isoeleutherin을 Aβ monomer와 함께 배양했을 때, 대조군에 비해 적은 수의 oligomer가 관측되었고 입자들의 부피가 줄어듦도 확인되었다. Thioflavin T를 이용한 분석결과도 이 naphthoquinone 유도체들이 현저한 농도 의존적 oligomerization 저해 효과를 가짐을 보였다. 다음으로, 이 약물들이 세포의 정상 생리에 영향을 미치는지 알아보기 위해 HT22 마우스 해마 세포주에서 naphthoquinone 유도체 처리 후의 sAPPα 레벨이 측정되었다. 흥미롭게도 24시간 약물 처리에 의해 sAPPα가 유의하게 증가하였고, 이를 통해 이 약물이 신경보호 효과를 가질 수 있음을 예측해보았다. HT22 세포주에서 다양한 산화적 스트레스를 주어 세포독성을 유발했을 때, 이 물질들의 전처리가 세포를 효과적으로 보호함을 확인하였다. 이러한 신경보호 효과에 sAPPα가 관여하는지를 알아보았는데, 과산화수소 처리에 의해 줄어든 sAPPα가 (+)-eleutherin이나 (−)-isoeleutherin 전처리에 의해서 회복됨이 관측되었다. 이 약물들은 또한 글루탐산에 의해 생성되는 활성 산소종도 현저히 줄였다. 산화적 스트레스는 소포체 스트레스 (endoplasmic reticulum stress: ER stress), 또는 미토콘드리아 기능장애와 밀접히 연관되어 있으므로, 두 세포내 소기관과 관련되는 단백질의 발현도가 약물처리에 의해 변화되는지를 확인해보았다. 글루탐산 처리에 의해 ER stress의 표지 단백질 (BiP/GRP78)과 ER stress에 의해 유도되는 친세포사 인자 (GADD153/CHOP)가 모두 증가되었지만, (+)-eleutherin의 전처리에 의해 정상화되었다. 항세포사 인자인 Bcl-2의 발현도는 글루탐산에 의해 변화되지 않았지만 미토콘드리아 관련 친세포사 인자인 Bax는 증가되었고 마찬가지로 약물 전처리에 의해 회복되었다. 마지막으로 (+)-eleutherin이 기관형 해마 조각 배양 (organotypic hippocampal slice culture: OHSC)에서 NMDA로 상승된 Aβ독성에 대해서도 신경보호 작용을 가지는지 연구되었다. 손상받은 세포에만 침투하는 PI의 형광도는 NMDA와 함께 처리된 Aβ (Aβ+NMDA)에 의해 CA1 지역 특이적으로 증가되었다. 하지만 (+)-eleutherin의 전처리로 PI 형광도가 유의적으로 감소됨을 확인했다. 또한, OHSC에서 Aβ+NMDA 처리에 의해 교란된 BiP/GRP78, GADD153/CHOP, Bcl-2, 그리고 Bax의 발현도도 (+)-eleutherin에 의해 복구되었다. 이 결과들을 종합해볼 때, (+)-eleutherin과 (−)-isoeleutherin은 NMDA 수용체를 매개하는 것으로 추정되는 Aβ 독성에 대해 보호효과를 갖는데, 이는 sAPPα 증가나 ER stress와 미토콘드리아 기능장애 회복을 통해 산화적 스트레스를 낮춤으로써, 또는 Aβ oligomerization을 저해함으로써 이루어진다는 증거를 제시하였다. 결론적으로 이 연구는 천연물 유래의 naphthoquinone 이성질체들이 AD 치료의 후보 약물로서 잠재력을 가지고 있음을 주장하는 바이다.