Enzymatic Preparation of Dicer Substrate RNA Nanostructures and Their Applications in Gene Regulation

Abstract

RNA간섭은 서열특이적 결합을 통해 표적 mRNA를 절단함으로써 단백질 발현을 억제한다. RNA간섭이 질병을 효과적으로 치료할 수 있다는 것이 알려지면서 다양한 유전자 관련 질병을 치료하기 위해 RNA를 사용하려는 시도가 계속되고 있으며 효과적인 유전자 침묵 연구를 수행하기 위한 구조의 응용이 수행되었다. 통상적으로 19+2 nt의 작은 siRNA가 사용되었으나 다이서에 의해 한번 절단된 RNA가 더 낮은 농도에서 지속적으로 효과를 낼 수 있다는 연구가 발표되었다. 이러한 비교적 긴 이중가닥 RNA를 다이서 기질 RNA라고 한다. RNA간섭에서 다이서의 역할은 miRNA를 적절한 크기로 자르고 RNA간섭을 유발하기 위해 RISC를 형성한다. 본 연구에서는 향상된 유전자 침묵 효과를 위한 3개의 팔을 가지고 있는 자가조립 Y-RNA 나노 구조체를 효과를 최적화 할 수 있도록 설계했으며 이를 이용해 여러 유전자 침묵 RNA를 동시에 전달할 수 있다. 또 효소적 합성 방법을 통해 DNA 주형가닥 및 진보된 RNA / DNA 가닥을 사용하여 다양한 형태의 Y-RNA 나노 구조체를 만들 수 있다.;RNA interference (RNAi) can modulate the translation of mRNA into proteins by cleaving specific sequences of target mRNA.1-3 Among various RNAs, a synthetic double strand RNA of 25-30 base pair in length can be recognized by a dicer and they are called as dicer substrate RNAs. Previous studies have shown that dicer substrate RNAs can effectively induce gene silence at lower concentrations than conventional siRNA with 19 base pairs in length.4 In this study, we have developed an enzymatic synthesis method of preparing self-assembled RNA nanostructures that can be utilized as potent Dicer substrate RNAs. Three arm junction RNA nanostructures (Y-RNA) are prepared and their gene silencing potency is evaluated as compared to the canonical siRNA (19+2). Through enzymatic synthesis, it is possible to obtain large amount of Y-RNA in a cost-effective way and resultant Y-RNA shows simultaneous and programmable gene silencing effect in cells. Finally, it is confirmed that the structural optimization of Dicer substrate RNAs is an important criteria for developing the next generation of RNAi therapeutics and our approach may enhance the therapeutic efficacy in clinical set-up.