Analysis of anaerobic C4-dicarboxylate antiporter in Actinobacillus succinogenes 130Z

Abstract

C4-디카르복실산 수송시스템은 세균에서 C4-디카르복실산의 흡수, 교환, 방출 등 다양한 기능을 담당하고, 미생물의 대사 및 성장에서 필수적이며 중요한 부분이다. C4-디카르복실산 중 하나인 숙신산은 고분자 화합물 생산을 포함한 여러 산업에서 사용되며, 전세계 시장은 2022년까지 미화 7억 5천만 달러에 육박할 것으로 예측된다. 자연적 숙신산 생산 균주인 Actinobacillus succinogenes 130Z의 숙신산 생산과 관련된C4-디카르복실산 수송시스템에 대한 연구는 현재 미미한 실정이다. 이에, 본 연구에서는 A. succinogenes 130Z의 C4-디카르복실산 수송시스템을 전사체분석과 수송측정분석을 포함한 다양한 생화학적·생물정보학적 방법으로 연구하였고, 이를 토대로 본 연구는 다음 세가지: 1) 전체 전사체분석을 통한 A. succinogenes 130Z의 C4-디카르복실산 수송단백질들의 발현특성, 2) A. succinogenes 130Z의 수송 특징, 3) C4-디카르복실산 수송단백질 Asuc_1999 (MstA; L-malate/succinate transporter of A. succinogenes, 본 연구에서 명명함)의 기능적인 특징을 증명하고자 하였다. 먼저, A. succinogenes 130Z의 전체 전사체 분석을 통해 A. succinogenes 130Z 내 37개의C4-디카르복실산 수송단백질들이 발현됨을 알 수 있었다. 그 중 8개의 C4-디카르복실산 수송단백질들이 상대적으로 과발현하였고, 특히 Asuc_1999(mstA)가 모든 실험 조건에서 가장 높은 발현을 보였다. 이에, MstA 자체의 기능적 특징 조사 연구를 본 연구의 추후단계에서 수행하였다. 두 번째로, A. succinogenes 130Z의 수송 특징 분석을 수행하였다. A. succinogenes 130Z의 혐기 푸마르산 수송 활성 Vmax와 Km이 55.8 μmol/gDW·min과 4.4 mM로 가장 높았고, 그 다음으로 L-말산은15.3 μmol/gDW·min과 1.4 mM이었고, 숙신산은 11.9 μmol/gDW·min과 1.2 mM인 것으로 측정되었다. 또한 A. succinogenes 130Z의 푸마르산 수송은 전기화학적 양성자 포텐셜과 pH 및 Na+의 변화도에 영향받는 것으로 나타났다. 또한, 야생형 A. succinogenes 130Z와 비교하였을 때, mstA가 결실된 돌연변이 A. succinogenes 130Z의 푸마르산 수송은 높은 농도일 때 감소하였고, 반면에 숙신산 수송에는 유의미한 차이가 없는 것으로 나타났다. 세 번째로, MstA의 기능적인 특징에 대한 연구를 수행하였다. MstA는 혐기조건에서 C4-디카르복실산 수송시스템이 결여된 돌연변이 대장균 IMW529의 수송 결함을 완전히 보완할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 MstA를 지닌 대장균 IMW529(0.16 h-1)는 대장균의 C4-디카르복실산 수송단백질 DcuB(DcuBEc)를 지닌 대장균(0.12 h-1)보다 혐기 푸마르산-글리세롤 배양조건에서 더 빠르게 성장하였다. MstA의 아미노산 서열은 DcuBEc와 높은 유사성을 보였으나, MstA에는 추가적인 102개의 아미노산이 있었고, 이를 삽입된 친수성 도메인(IHD)으로 명명하였다. IHD의 삽입과 제거는 성장과 산물 생산에 영향을 주지 않았으나 푸마르산과 숙신산의 수송은 약간 증가시켰다. MstA의 혐기 수송활성 Vmax와 Km은 푸마르산에서는 21.57 μmol/gDW·min과 452 μM이었고, L-말산에서는 20.04 μmol/gDW·min과 57 μM인 반면, 숙신산에서는 5.38 μmol/gDW·min과 364 μM로 측정되었다. 기질특이성 및 수송 교환 실험을 통해 MstA의 가장 선호되는 기질은 L-말산임을 밝히었다. 결과들을 토대로 Asuc_1999(MstA)가 L-말산과 숙신산의 역방향수송체임을 증명하였다. ;The C4-dicarboxylate transport system is one of the essential parts underpinning microbial metabolism and growth because it is responsible for a large number of different functions in bacteria including uptake, exchange or efflux of C4-dicarboxylates. Succinate, one of C4-dicarboxylates, is used in many industries including synthesis of various polymer compounds, and the global succinate market is expected to reach USD 750 million by 2022. Some studies have shown that the C4-dicarboxylate transport system in different bacterial species, but the C4-dicarboxylate transport system of Actinobacillus succinogenes 130Z, a natural succinate producer, still remains poorly understood. Therefore, in this study, the C4-dicarboxylate transport systems of A. succinogenes 130Z were investigated by using various biochemical and bioinformatic methods including global transcriptome analysis and transport assays under anaerobic conditions to elucidate: 1) the expressions of C4-dicarboxylate transporters through global transcriptome analysis of A. succinogenes 130Z, 2) the transport characteristics of A. succinogenes 130Z, 3) the functional characterization of a C4-dicarboxylate transporter Asuc_1999 (MstA; L-malate/succinate transporter of A. succinogenes, named in this study). First, the expressions of C4-dicarboxylate transporters through global transcriptome analysis of A. succinogenes 130Z were investigated. The expressions of 37 different C4-dicarboxylate transporters in A. succinogenes 130Z were detected, and eight potential C4-dicarboxylate transport systems showed high expression. Asuc_1999 (mstA) showed the highest expression under all conditions among the C4-dicarboxylate transporters. Second, the transport characteristics of A. succinogenes 130Z were investigated. The anaerobic uptake, Vmax and Km, of A. succinogenes 130Z for fumarate was highest, 55.8 μmol/gDW·min and 4.4 mM, and those for L-malate and succinate were 15.3 μmol/gDW·min and 1.4 mM; 11.9 μmol/gDW·min and 1.2 mM, respectively. The fumarate uptake of A. succinogenes 130Z was influenced by electrochemical proton potential, pH gradient, and Na+ gradient. Compared to wild-type A. succinogenes 130Z, the fumarate uptake of the mstA deletion mutant A. succinogenes 130Z decreased at high fumarate concentrations, whereas succinate uptake remained in similar level regardless of succinate concentrations. This indicates the involvement of other transporters in the succinate uptake of the A. succinogenes 130Z. Third, the functional characterization of MstA was investigated. The MstA fully complemented the transport deficiency of the C4-dicarboxylate transporter-deficient mutant Escherichia coli IMW529 under anaerobic conditions. The E. coli IMW529 with MstA grew faster (0.16 h-1) than with DcuB of E. coli (DcuBEc) (0.12 h-1) under anaerobic fumarate-glycerol conditions. The amino acid sequence of MstA showed high similarity to DcuBEc, but there was an 102-amino-acid unknown additional domain called the Intercalating Hydrophilic Domain (IHD). The deletion or insertion of the IHD region did not affect growth and production but increased transport of fumarate and succinate uptake slightly. The anaerobic uptake activities, Vmax and Km, of MstA for fumarate and L-malate were 21.57 μmol/gDW·min and 452 μM; 20.04 μmol/gDW·min and 57 μM, respectively, and that for succinate was 5.38 μmol/gDW·min and 364 μM. Based on the substrate specificity and the transport exchange experiments, L-malate was identified as the preferred substrate of MstA. This suggests Asuc_1999 (MstA) as an L-malate/succinate antiporter.