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Identification of OCTN variants and their association with phenotypes of Crohn’s disease

Title
Identification of OCTN variants and their association with phenotypes of Crohn’s disease
Other Titles
한국인에서의 OCTN 수송체 프로모터 유전자 변이에 대한 기능 연구 및 크론병과의 연관성 연구
Authors
박효진
Issue Date
2018
Department/Major
의학전문대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 의학전문대학원
Degree
Doctor
Advisors
최지하
Abstract
연구 배경과 목적: Organic cation/carnitine transporter (OCTN) 은 solute carrier (SLC) 22A subfamily에 속하는 수송체로, 사람에서는 두 아형인 OCTN1과 OCTN2이 존재한다. OCTN은 세포 내에서 항산화작용을 하는 ergothioneine을 포함하여 여러 기질을 수송하면서 발현된 조직 내에서 세포를 보호하는 역할을 한다. OCTN1 또는 OCTN2의 유전자 변이에 대한 기능 연구는 아직까지 보고된 바가 많지 않다. 최근 OCTN1의 L503F 유전자 변이와 OCTN2의 g.-207C>G 프로모터 유전자 변이가 크론병의 감수성 및 임상 증상과 유의한 상관성을 가진다는 것이 보고되었다. 하지만 아직까지 OCTN 수송체가 크론병의 발생 및 경과에 미치는 기전은 명확하게 밝혀지지 않았다. 또한, 이 두 OCTN 변이는 아시아인에서 없는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 한국인에서 OCTN 프로모터의 유전자 변이를 찾고 각 변이에 대한 기능 연구를 진행하였으며, 한국인에서 OCTN 유전자 기능 변이와 크론병 감수성 및 임상 경과 간의 상관성을 분석하였다. 연구 방법: 48명의 건강한 한국인으로부터 얻은 DNA 샘플을 이용하여 OCTN 프로모터 부분을 직접 염기서열법으로 분석하였다. 그리고 찾은 변이와 일배체형이 OCTN 프로모터의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 luciferase 활성을 측정했다. 다음으로, 각 변이가 OCTN의 전사를 조절하는 기전을 알아보기 위해 전사 인자 결합 위치 예측, 젤 지연 분석법, 전사 인자 과발현 혹은 발현 억제 실험을 수행하였다. 마지막으로, OCTN의 기능성 변이가 크론병에 대한 감수성 혹은 임상 경과와 연관이 있는지 알아보고자 194명의 한국인 크론병 환자와 289명의 건강한 사람으로부터 얻은 DNA 샘플을 이용하여 유전자 분석을 수행하였다. 연구 결과: 본 실험 결과, 3개의 OCTN1 프로모터 일배체형과 1개의 OCTN2 프로모터 일배체형이 reference에 비해 프로모터 활성을 감소시켰다. 각 일배체형에 있는 변이 중, 특히 OCTN1에 있는 2개의 프로모터 변이는 해당 유전자 전사 활성을 유의하게 감소시켰고, 다른 2개의 변이는 활성을 증가시켰다. OCTN2의 경우, 일배체형에 존재하는 2개의 변이에 의해 OCTN2 프로모터 활성이 감소했다. 또한, 변이 유무에 따라 OCTN 프로모터와의 결합력에 차이가 있는 전사 인자 중, NF-Y는 OCTN1 전사를 억제하고, NF-E2와 YY1은 OCTN2의 전사를 촉진시켰다. 크론병과의 상관성 분석 결과, OCTN 프로모터의 기능성 유전자 변이는 크론병 감수성과는 관련이 없었다. 하지만, OCTN 프로모터 활성을 감소시키는 일배체형은 심각한 질환 증상인 관통형 양상과 유의한 상관관계가 있었고, 특히 OCTN2 일배체형은 높은 수술 빈도와도 유의한 상관성을 보였다. 연구 결론: 본 연구에서는 한국인에서 찾은 OCTN1 또는 OCTN2 프로모터 유전자 변이 및 일배체형이 각 유전자의 전사를 증가 혹은 감소시켰고, 이러한 조절 기전에는 NF-Y, NF-E2, 그리고 YY1가 작용하였다. 또한 OCTN 전사를 감소시키는 기능성 프로모터 일배체형이 한국인 크론병 환자들의 임상 경과 중 관통형 질병 양상 및 높은 수술 빈도에 대한 위험 인자로 참고할 활용 가능성을 제시했다.;BACKGROUND: Human organic cation/carnitine transporter (OCTN), a member of the solute carrier 22 A family, has two isoforms, namely OCTN1 and OCTN2. OCTNs transport several substances such as ergothioneine, an intracellular antioxidant, and perform protective roles in tissues in which they are expressed. To date, few functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been identified and characterized in OCTN1 or OCTN2. Recent studies indicate that SNPs L503F and g.-207G>C in OCTN1 and OCTN2, respectively, are significantly associated with susceptibility to or severity of Crohn's disease (CD). However, the precise roles of OCTNs in the development and/or progression of CD are unclear. Moreover, SNPs L503F and g.-207G>C are absent in the OCTN genes of Asian populations. The present study identified and characterized functional genetic variants in OCTN promoters and investigated their association with CD in the Korean population. METHODS: Promoter regions of OCTN1 and OCTN2 were directly sequenced from DNA samples obtained from 48 healthy Korean individuals. Promoter luciferase assays were performed to investigate the effect of variants or haplotypes on promoter activities. In vitro assays, including transcription factor binding site analyses, electrophoretic mobility shift assays, and luciferase assays after overexpression or knockdown of transcription factors were performed to evaluate the effect of each variant on the transcriptional regulation of OCTN1 and OCTN2. Finally, genetic analyses were performed using DNA samples obtained from 194 Korean patients with CD and 287 healthy controls to investigate the association between the functional variants in OCTN1 and OCTN2 promoters and the susceptibility to or clinical course of CD. RESULTS: Results of this study showed that 3 haplotypes of the OCTN1 promoter and 1 haplotype of the OCTN2 promoter increased or decreased the transcriptional activities of these promoters compared with those of the references. Particularly, 2 variants in the OCTN1 promoter significantly decreased its transcriptional activity while 2 other variants in the same promoter increased its transcriptional activity. Two SNPs in the OCTN2 promoter decreased its transcriptional activity. Further, results of this study showed that nuclear factor Y (NF-Y) repressed the transcriptional activity of the OCTN1 promoter and nuclear factor erythroid 2 (NF-E2) and Yin Yang 1 (YY1) increased the transcriptional activity of the OCTN2 promoter, altering the binding affinities of these promoters depending on the variants present. In the association study, the haplotypes with reduced promoter activities of OCTN1 and OCTN2 were associated with clinical course of CD penetrating behavior. Additionally, the OCTN2 haplotype was significantly correlated with a high frequency of having surgery in CD patients. However, susceptibility to CD was not associated with any of the varaints in or haplotypes of OCTN1 and OCTN2. CONCLUSION: These results suggested that common haplotypes of the OCTN1 and OCTN2 promoters regulated the transcription rates of their respective genes and that NF-Y, NF-E2, and YY1 were involved in this regulation. In addition, functional haplotypes of the OCTN1 and OCTN2 promoters that decreased their transcriptional activities were significantly associated with the penetrating form of CD or high frequency of surgery in Korean patients with CD.
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