Anti-aging effects of L-histidine and L-carnosine on D-galactose-induced aging

Abstract

L-histidine is a naturally existing amino acid found in low concentration in the body. L-carnosine (β-alanyl-L-histidne) is a dipeptide composed of β-alanine and L-histidine and is found in brain, skeletal muscle, and liver. Anti-aging functions of each of L-histidine and L-carnosine have been widely studied. Since brain and skin share common molecular and hormonal mechanisms in aging process, present study investigated the anti-aging effects of L-histidine, L-carnosine, and their combination against D-galactose-induced aged brain and skin in in vitro and in vivo systems. To investigate the anti-aging effects of L-histidine, L-carnosine, and their combination, in vitro experiments using RA-differentiated SH-SY5Y cell and HaCaT cell, and in vivo experiments using C57BL6/N mice were used. Cellular senescence was significantly inhibited by L-histidine, L-carnosine, and their combination in both RA-differentiated SH-SY5Y and HaCaT cells. Moreover, L-histidine, L-carnosine, and their combination efficiently alleviated several aging-related signs induced by D-galactose in differentiated SH-SY5Y cells. Their treatment increased the cellular proliferation and neurogenesis by regulating related protein expressions, β-tubulin Ⅲ and NEFH, in differentiated SH-SY5Y cells. In addition, L-histidine, L-carnosine, or their combination was able to inhibit the formation and secretion of Amyloid beta (Aβ) (1-42). Their treatment up-regulated the protein expressions of anti-oxidant enzymes such as glutathione peroxidase-1 (GPX-1) and superoxide dismutase-1 (SOD-1) and down-regulated protein level of apoptosis marker, cleaved caspase-3. Moreover, they inhibited mRNA level of cytokines, IL-8, IL-1β and TNF-α. In HaCaT cell, L-histidine, L-carnosine, and their combination restored the cellular proliferation and wound healing ability impaired by D-galactose. Additionally, protein expression of E-cadherin was down-regulated, while the protein expressions of N-cadherin and MMP-2 were up-regulated by L-histidine, L-carnosine, and their combination. To confirm the in vitro data, animal experiments were performed. C57BL6/N mice were divided into 5 groups as follows: Mice received saline (Ctrl), D-galactose (500 mg/kg) (D-gal); D-gal + L-histidine (2 g/L) (His); D-gal + L-carnosine (2 g/L) (Car); or D-gal + combination of L-histidine (2 g/L) and L-carnosine (2 g/L) (His+Car). D-galactose injection and L-histidine, L-carnosine, or both supplementations were performed for every day for 8 weeks. As a result, L-histidine, L-carnosine, and their combination attenuated the loss of body and organ weights caused by D-galactose. In addition, they efficiently protected the neuronal degeneration by D-galactose and restored the protein expressions of GPX-1, SOD-1 and cleaved caspase-3. L-histidine, L-carnosine, and their combination also increased the dermal thickness and skin collagen contents. Moreover, they accelerated wound healing which was significantly delayed by D-galactose. L-histidine and L-carnosine enhanced wound healing by up-regulating epithelial mesenchymal transition (EMT) process. In conclusion, the present study represents that L-histidine and L-carnosine were able to inhibit brain and skin aging induced by D-galactose confirmed by in vitro and in vivo system.;L-히스티딘은 자연상태에 존재하는 아미노산으로 우리 몸에 소량 존재한다. L-카르노신은 베타알라닌과 L-히스티딘이 합성되어 만들어진 다이펩타이드로 뇌, 골격근, 간에서 주로 발견된다. D-갈락토오스는 단백질과 펩타이드에 존재하는 자유 아민들과 쉽게 반응하여 최종당화산물들을 만든 후, 산화적 스트레스를 발생시키는 환원당이다. 뇌와 피부의 노화 과정이 서로 긴밀하게 연관되어 있다는 최근 연구 결과들의 발표에 따라, 뇌와 피부를 동시에 연구하고, 두 기관의 상관관계를 평가하는 연구가 최근 항노화 연구 분야에서 주목을 받고 있다. 따라서 본 연구는 D-갈락토오스라는 하나의 물질이 뇌와 피부의 노화를 유도시킬 수 있고, L-히스티딘과 L-카르노신이 항노화 효능을 지닐 것 것이라는 가설을 세우고, 이를 입증하기 위해 세포실험과 동물실험을 진행하였다. 세포실험에는 레티노산으로 분화시켜 신경세포로 유도한 SH-SY5Y와 피부 상피 세포인 HaCaT 세포를 사용하였으며, 동물실험에는 12주령 C57BL6/N 마우스를 사용하였다. 세포와 마우스 모두 D-갈락토오스 처리를 통해 노화를 유도시켰고, D-갈락토오스 처리와 동시에 L-히스티딘과 L-카르노신을 각기 또는 혼합 투여하여 항 노화 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과, 신경 세포의 경우, L-히스티딘과 L-카르노신을 처리하였을 때 D-갈락토오스로 유도된 세포 노화가 억제됨을 확인하였다. 더불어, L-히스티딘과 L-카르노신 투여로 세포 증식 능력과 신경돌기의 길이가 증가하였고, 신경조직발생과 관련된 베타 튜블린 Ⅲ와 NFH의 단백질 발현이 증가함을 확인하였다. 더불어, 알츠하이머 치매에 결정적으로 관여하는 아미노산 펩타이드인 아밀로이드 베타의 단백질 발현은 감소하고, 그 전구체인 아밀로이드 전구체 단백질의 발현은 증가함을 확인하였다. 또한, 마우스의 뇌조직의 조직학적인 분석을 한 결과, L-히스티딘과 L-카르노신을 투여한 그룹이 D-갈락토오스 그룹에 비해 뇌조직의 조밀도가 높고, 전체적인 뇌 구조가 잘 보존되었음을 확인하였다. 더불어 신경 세포와 마우스 뇌 조직에서 모두 L-히스티딘과 L-카르노신을 투여로 인해 대표적인 항산화 효소인 SOD-1과 GPX-1의 단백질 발현이 증가되고, 세포사멸의 대표적인 마커인 cleaved caspase-3의 단백질 발현은 감소되었으며, 면역 사이토카인의 일종인 interleukin (IL)-1β, IL-8, TNF-α 의 mRNA 발현이 감소함을 발견하였다. 피부 상피 세포에서 또한 D-갈락토오스로 유도된 세포 노화가 L-히스티딘과 L-카르노신 처리로 억제되었으며, 세포증식은 증가하였다. 더불어 피부 상피 세포와 마우스 피부에 상처를 낸 후 상처 치유 효과를 확인한 결과, 노화 군에서는 상처치유가 느리게 나타났으며, L-히스티딘과 L-카르노신을 처리했을 때 상처 치유 속도가 빠르게 나타남을 확인하였다. EMT (epithelial mesenchymal transition) 는 상피세포가 간엽세포의 성질을 획득하는 현상을 말하는데, 이 과정을 통해 세포가 운동성을 획득하여 상처 부위를 다시 덮게 되는 상처 치유 과정에서 중요한 과정이다. 본 연구에서는 EMT에 관여하는 마커들의 단백질 발현 확인을 통해 D-갈락토오스를 처리함으로써 상처 부위 EMT 과정이 억제됨을 확인하였으며, L-히스티딘과 L-카르노신을 처리함에 따라 EMT 과정이 다시 증대됨을 발견하였다. 따라서, L-히스티딘과 L-카르노신이 EMT 과정 증대를 통해 상처 회복 능력을 증가시킨다는 것을 규명하였다. 더불어 L-히스티딘과 L-카르노신을 투여한 마우스의 피부가 D-갈락토오스 단독 처리한 마우스보다 두께가 더 두꺼웠으며, 콜라겐 함량이 증가함을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구는 뇌와 피부 노화 기전의 상호관계성에 대한 근거를 제시하였으며, L-히스티딘과 L-카르노신을 각기 또는 혼합으로 처리했을 때 뇌와 피부에서 항산화, 항염증, EMT 과정 증대를 통한 상처 치유 효과 증대 등의 기전들을 통해 항노화 효과를 발휘함을 밝혀내었다. 더불어, 본 연구는 L-히스티딘과 L-카르노신이 서로 항노화 효과 뿐 아니라 다른 질병의 예방 및 치료에도 효과가 있을 수 있는 가능성을 제시하며, 향후 기전연구를 통한 건강기능식품 및 약제 개발에 활용함으로써 궁극적으로 국민의 질적 건강 향상을 도모한다는데 의의가 있다.