PART Ⅰ: The function of cathepsin S in regulating BRCA1 protein stability by DNA damage response, PART Ⅱ: DNA damage response and cellular proliferation effects of bisphenol A

Abstract

PART1. Cathepsin S (CTSS) is a cysteine protease that is thought to play a role in many pathological and physiological processes including metastasis, tumor growth and angiogenesis. It has been identified as a radiation response gene. Here, we demonstrated the role of CTSS in regulating the DNA damage response in breast cancer cells. Activating CTSS (producing the cleavage form of the protein) by radiation induced proteolytic degradation of BRCA1, which ultimately suppressed DNA double-strand break repair activity. Depletion of CTSS by RNAi or expression of a mutant type of CTSS enhanced the protein stability of BRCA1 by inhibiting its ubiquitination. CTSS interacted with the BRCT domain of BRCA1 and facilitated ubiquitin-mediated proteolytic degradation of BRCA1, which was tightly associated with decreased BRCA1-mediated DNA repair activity. Treatment with a pharmacological CTSS inhibitor inhibited proteolytic degradation of BRCA1 and restored BRCA1 function. Spontaneously induced rat mammary tumors and human breast cancer tissues with high levels of CTSS expression showed low BRCA1 expression. From these data, we suggest that CTSS inhibition is a good strategy for functional restoration of BRCA1 in breast cancers with reduced BRCA1 protein stability. PART2 Bisphenol A (BPA) is a well-known endocrine disruptor, used as hardner of plastics or plasticizers. Due to the ubiquitous presence of BPA in the environment of human society, human exposure to BPA is inevitable and widespread as revealed by human biomonitoring data. BPA possesses endocrine disrupting activities and increasing concerns are raised around its harmful effects on the reproductive organs and sexual maturation and linked obesity, diabetes and Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD). More seriously, some studies provide with several lines of evidence alluding proliferative and potential carcinogenic effects of BPA on diverse organs. Possible association of BPA exposure and hepatic tumor. But its relevance to human has not been fully clarified. Here we demonstrated that BPA could induce cell proliferation and DNA damage in human hepatocyte cell-lines. BPA significantly increased cellular proliferation from 300 nM BPA in HepG2 and NKNT-3 cells as determined by DNA synthesis assay and elevated expression of cell cycle related proteins. However, at concentrations higher than 10 mM, these effects disappeared, reflecting non-monotonic dose-response relationship. Of note, activation of p-H2AX, a sensitive biomarker for DNA damage was observed reflecting that DNA damage accompanied increased cell proliferation. Examination of the liver tissue from juvenile animals orally exposed to BPA at 0.5 mg/kg for 90 days confirmed the proliferative foci and DNA damages. Reactive oxygen species appeared to contribute as supported by partial reversal of BPA-induced cell proliferation and DNA damage by antioxidant, N-acetylcysteine (NAC). Collectively, these results demonstrated that BPA may induce DNA damage and promote cell proliferation of hepatocyte cells, which may support its potential carcinogenicity.;PART1 카뎁신S (Cathepsin S; CTSS)는 종양의 성장과 신생혈관형성 그리고 암의 전이에 관계되는 시스테인 단백분해효소로 암의 형성과 전이에 관여되며 방사선에 의해 활성화 되어 방사선 저항성을 유도하는 유전자로 규명되었다. 본 연구에서는 카뎁신S의 유전자손상반응 조절 기전을 유방암세포에서 확인하고자 하였다. 활성화된 카뎁신S는 유전자 손상 복구 과정 중 상동재조합 과정에 관여하여 유전자 손상 반응을 조절하는 BRCA1의 단백분해를 유도하여 BRCA1의 유전자 이중나선 (Double strand break) 수복활성을 감소시켰다. 또한 카뎁신S의 발현을 짧은 간섭 RNA를 처리해 억제하였을 때 BRCA1의 단백질 안정성이 증가되며 유전자 이중나선 수복활성이 증가되었다. 카뎁신S는 BRCA1의 카복실 말단 영역인 BRCT 영역과 결합하여 유비키틴 의존적 단백분해를 유도하였고 이것은 BRCA1에 의한 유전자수복활성을 감소시켰다. 더 나아가 카뎁신S 저해 약물을 처리했을 때 BRCA1의 단백분해가 감소되었고 BRCA1의 기능이 회복되었다. 방사선 또는 발암물질 (DMBA)로 유도된 랫트의 유방암에서 높은 수준의 카뎁신S 발현과 낮은 BRCA1의 발현을 보였고 동물실험에서 카뎁신S를 저해시킨 세포로 유도한 종양모델에서 카뎁신S 저해군의 종양성장 속도가 대조군에 비해 감소한다. 이로써 카뎁신S의 저해는 유방암에서 BRCA1의 기능을 회복할 수 있는 좋은 전략이 될 것으로 제안한다. PART2 비스페놀 A (Bisphenol A; BPA)는 잘 알려진 환경호르몬으로 폴리카보네이트(PC)나 에폭시수지 같은 플라스틱 제조의 원료으로 사용되며 우리 일상생활에서 자주 접할 수 있는 환경 오염물질이다. 비스페놀 A는 인체의 다양한 호르몬 수용체에 결합하여 호르몬의 정상 기능을 방해하여 생체모니터링에서 생식기능장애나 당뇨, 비만 행동장애에 대한 연관성이 제기되고 있다. 특히나 에스트로겐수용체에 결합하여 다양한 기관의 잠재적 발암물질로 제기되고 있다. 특히나 비스페놀 A의 간암과의 관계성이 제기되고 있지만 아직 확실히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 인체 간세포를 이용해 BPA의 세포증식과 유전자손상반응을 유도하는지 확인하였다. 간암세포인 HepG2세포와 간세포인 NKNT-3세포 는 300 nM의 BPA를 처리 하였을 때 세포주기 관련 단백질의 증가와 세포증식능이 증가하였다. 또한 유전자손상 마커 중 하나로 알려진 p-H2AX가 세포증식과 함께 BPA에 의해 유도되었으며 BPA를 90일 동안 경구로 투여 받은 동물모델 (랫트)의 간조직에서 gH2AX의 발현이 증가되어 있는 것을 조직염색으로 확인하였다. 이러한 결과는 BPA가 간세포에서 유전자 손상을 일으키고 세포의 증식을 촉진시킨다는 것을 증명하여 잠재적 발암물질의 가능성을 제기한다.