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Effects of Ionizing Radiation and RF-EMF on Amyloid Precursor Protein Processing and its Association with HSP27

Title
Effects of Ionizing Radiation and RF-EMF on Amyloid Precursor Protein Processing and its Association with HSP27
Other Titles
방사선과 전자파가 Amyloid Precursor Protein Processing에 미치는 영향과 HSP27과 Amyloid Precursor protein의 연관성
Authors
최소정
Issue Date
2018
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
이윤실
Abstract
알츠하이머는 기억, 사고 및 행동에 문제를 일으키는 뇌 질환으로 65세 이상의 노령인구에서 발생 빈도가 꾸준히 증가하고 있다. 알츠하이머를 일으킨다고 알려진 두 가지 가설이 있는데 그 중 하나인 아밀로이드 가설은 아밀로이드 베타가 세포에 독성을 가지며 알츠하이머를 유발한다는 가설이다. 본 논문에서 연구된 알츠하이머 관련 요인은 세 가지가 있다. 첫 번째로 Radio Frequency Electromagnetic Fields (전자파, RF-EMF) 가 있다. 현재 'LTE (Long Term Evolution)' 이동통신망의 보급이 증가하는 추세이므로 LTE RF-EMF가 가장 가까이 노출되는 뇌에 어떠한 영향을 미치는 지 관련 연구가 많이 진행되어 있지 않아 연구가 필요한 추세이다. 두 번째로 방사선 이 있다. 방사선 현재 뇌암에 가장 보편적인 치료법 중의 하나이나 알츠하이머의 병리학적 요소 중 하나인 인지능력 손상을 유발한다는 논문이 발표되고 있다. 하지만 알츠하이머를 유발한다고 알려진 대표적인 가설과 관련된 연구는 많이 진행되어 있지 않아 연구가 필요한 실정이다. 마지막으로 열충격단백질 27 (Heat shock protein 27, HSP27)이다. HSP27은 본 연구에서 Alzheimer's disease를 억제하는 후보단백질로 나타났다. 따라서 이 세 가지 논쟁을 중심으로 연구를 진행하였다. 전자파의 경우 24시간동안 8W/kg의 세기로 노출한 후 amyloid precursor protein(APP) processing과 세포사를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 방사선은 5Gy, 10Gy세기로 노출시킨 후 48시간 동안 배양 하였다. 그 후 APP processing과 세포사를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. HSP27은 APP와의 연관성을 찾기 위해 면역침전법과 Cycloheximide 처리법을 진행하였다. 그 결과 세포를 방사선에 노출시켰을 때 알려진 대로 세포사가 증가하는 것으로 나타났고 APP의 단백질 안정성이 감소함을 확인할 수 있었다. 노출된 지 48시간 후에는 BACE1의 발현은 증가하고 ADAM10의 발현은 변화하지 않았지만 CTFs는 세기에 따라 감소하는 경향을 보였는데 이는 APP의 단백분해와 연관이 있을 것이라 사료된다. 전자파를 24시간 노출시켰을 때는 아주 약한 세포사가 발생하였고 APP의 단백분해 또한 관찰할 수 있었다. 그러나 BACE1과 ADAM10의 유의미한 변화를 관찰할 수 없었고 CTFs의 유의미한 변화 또한 관찰할 수 없었다. 이는 전자파가 방사선처럼 강력한 손상인자가 아니기 때문이어서 발생한 현상이라고 생각된다. 그리고 위의 두 실험 모두 HSP25 과발현세포가 정상세포보다 세포사가 완화됨을 관찰할 수 있었고 APP의 단백질 또한 더 안정적으로 유지되었다. 따라서 HSP27과 APP의 관계를 증명하기 위해 면역침전을 진행한 결과 APP와 HSP27이 결합함을 알 수 있었다. HSP27이 APP의 half life에 관여하는지 확인하기 위해 Cycloheximide를 처리하여 실험을 진행한 결과 HSP27이 APP의 half life에 관여함을 확인할 수 있었다. 결론적으로 HSP27은 APP에 직접 결합하여 APP의 안정성을 증가시키고 half life를 길게 유지할 수 있도록 했다. 더 자세한 각 요소들의 기전에 대한 규명은 향후 실험에서 진행될 것이다.;Alzheimer’s disease is a disease of the brain that causes problems with memory, thinking and behavior. Alzheimer's disease has a steady increase in the incidence of elderly people aged 65 years and older. There are hypothesis that amyloid β, which is toxic to cells, aggregates and causes alzheimer’s disease. Currently, the spread of LTE (Long term evolution) mobile communication network has increased. Therefore, it is necessary to study the effect of LTE radio frequency electromagnetic fields (RF-EMF) on the nearest exposed brain, especially focus on alzheimer disease development. Ionizing radiation (IR) is currently one of the most common therapies for brain tumors, but it has been reported that it causes cognitive dysfunction, one of the pathological elements of alzheimer's disease. However, there are few reports to identify the molecules that cause alzheimer's disease. Moreover, in this study, HSP27 was evaluated for the candidate protein for inhibition of alzheimer disease development. The RF-EMF was exposed to the cells for 24 hours at an intensity of 8W/kg and the amyloid precursor protein (APP) processing and cell death effects were examined. IR was irradiated to cells at 5 Gy or 10 Gy for 48 hours and the protein related to APP processing and cell death were also examined. Immunoprecipitation and cycloheximide assays were performed to determine the association of HSP27 with APP. As a result, the expression of BACE1 (β-secretase 1) was increased in a dose dependent manner after 48 hours of IR. However, the tendency of amyloidogenic APP processing product, CTFβ (C-terminal fragment β) and nonamyloidogenic APP processing product, CTFα were not increased. IR dose dependent degradation of APP was observed accompanied with decreased expression of CTFβ and CTFα. In this time points, IR induced cell death when it was determined with flow cytometry or apoptosis markers expression such as cleaved PARP and cleaved caspase 3. In the case of RF-EMF, no significant changes of ADAM10 and BACE1 were observed, but the degradation of APP was observed similar to IR. However, unlike IR, a significant decrease in CTFs was not observed. RF-EMF has also proven to be a weak damage factor in experiments for measuring cell death. Immunoprecipitation (IP) and cycloheximide (CHX) assays were performed to determine the pathway to increase the stability of APP. As a result, HSP27 (HSP25) increased the stability of APP by binding directly to APP. In addition, the half life of APP was measured by the CHX assay and the half life of APP was found to be longer when HSP27 (HSP25) was overexpressed. Taken together, HSP27 can directly bind to APP to improve APP stability and increase protein half life. Identification of more detailed mechanisms will be needed in the further studies.
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