Actinobacillus succinogenes의 C4-Dicarboxylate 수송체 Asuc_1999 막위상 모델 구축

Abstract

물질대사에서 중요한 역할 담당하는 막수송단백질의 기능을 연구하기 위해서는 구조적인 측면에서의 분석이 요구된다. 본 연구에서는 다량의 숙신산을 생산하는 반추위 세균 Actinobacillus succinogenes의 주요한 C4-디카르복시산 수송단백질인 fumarate/succinate antiporter Asuc_1999의 막위상 모델을 구축하였다. 이를 위하여 Asuc_1999의 친수성 부위의 막위상을 실험적으로 측정하였으며, 공용 데이터베이스를 이용한 in silico 연구를 병행하였다. 막위상의 실험적 분석을 위하여, 먼저 TMHMM(TransMembrane Hidden Marcov Model)에 의한 Asuc_1999의 초안 모델을 기반으로, 루프상의 14개 측정위치를 지정하였다. 이 14지점의 C-terminal에 alkaline phosphatase(PhoA)와 β-galactosidase(LacZ)를 각각 퓨전시켰다. PhoA는 주변세포질에서, 그리고 LacZ는 세포질에서 활성을 띄므로, 이 PhoA/LacZ 활성비에 따라 각 지점의 막위상을 결정하였다. 이 또한 실험적 분석값을 보완하기 위하여 in silico 분석을 병행하였다. 막단백질 서열의 막위상 예측 프로그램인 TMHMM, ∆G predictor, MEMSAT(MEMbrane protein Structure And Topology)-SVM, MEMSAT3, TOPCONS(Consensus prediction of membrane protein topology and signal peptides)를 사용하였으며, 추가적으로 단백질 2차 구조 예측 프로그램인 PSIPRED (PSI-blast based secondary structure PREDiction)를 사용하였다. 본 연구에서 얻어진 Asuc_1999의 막위상 모델에서는 13개의 transmemrane(TM)이 존재하며 N-terminal은 세포질에 위치한다. 또한 Asuc_1999에는 274D~375N 사이의 약 100개 아미노산 루프인 IHD(Intercalating Hydrophilic Domain)가 8번과 9번 TM 사이의 주변세포질에 위치하는데, 이 IHD를 제외하면 Asuc_1999는 E. coli의 fumarate/succinate antiporter인 DcuB와 75% 아미노산 서열 일치도를 보인다.;Membrane transporter plays an important role in cellular metabolism. The structural analysis for membrane transporter is required to understand the transport function. In this study, Topology model of the fumarate/succinate antiporter Asuc_1999 of Actinobacillus succinogenes was constructed. Asuc_1999 is a major C4-dicarboxlate transporter in natural succinate producer A. succinogenes. Topology of hydrophilic regions of Asuc_1999 was experimental determined, in parallel, the several membrane topology prediction database was used to in silico analysis.On the basis of TMHMM (TransMembrane Hidden Marcov Model), 14 measuring points on the hydrophilic loop were detemined. Each of C-terminal in 14 points were fused with alkaline phosphatase (PhoA) and β-galactosidase (LacZ). PhoA has an activity in periplasm and LacZ in cytoplasm. Therefore, Topology on each point was determined by activity ratio of PhoA/LacZ.The experimental results were improved with in silico analysis. Amino acid sequence based membrane topology predicting program TMHMM, ΔG predictor, MEMSAT (MEMbrane protein Structure And Topology)-SVM, MEMSAT3, TOPCONS (Consensus prediction of membrane protein topology and signal peptides), in addition, protein second structure predicting program PSIPRED (PSI-blast based secondary structure PREDiction) were used. Topology model of Asuc_1999 in this study has 13 transmembrane (TM), and N-terminal of Asuc_1999 is located in cytoplasm. Asuc_1999 has a long hydrophilic periplasmic loop Intercalating Hydrophilic Domain (IHD) between 274D~375N, which located in periplasm between 8th and 9th transmembrane. Except for IHD, Asuc_1999 has 75% amino acid sequence identity with E. coli fumarate/succinate antiporter DcuB.