KeraSkin™-VM을 이용한 피부자극성 동물대체시험법 검증연구

Abstract

The purpose of the study is to evaluate predictive capacity of in vitro skin irritation test using KeraSkin™-VM which is reconstructed human epidermis (RhE) model. 3 laboratories conducted 3 repeated tests. According to the performance standard of OECD TG 439, 20 reference chemicals were applied to the RhE tissue and cell viability was measured. Then we made a categorical decision by 50% cut-off whether the chemical was irritant or non-irritant. Compared with the UN GHS categories, we calculated the predictive capacity (specificity, sensitivity, accuracy) based on the previous research methods such as 1) mode prediction, 2) individual lab prediction, 3) majority of run sequences prediction and 4) mispredicted test/total prediction with 95% Wilson CIs. In addition, we estimated 95% confidence intervals by using the simple percentile bootstrap method. In conclusion, mispredicted test/total prediction was the most appropriate method to calculate the predictive capacity of the validation study because the method could not only reflect the individual predictions of 3 run sequences in all laboratories but also estimate the shortest Wilson CIs. However simple percentile bootstrap method needed the further predictions of the additional chemicals to get precise confidence intervals.;본 연구의 목적은 인체 피부세포에서 유래한 인공피부모델(Reconstructed Human Epidermis model, RhE) KeraSkin™-VM을 이용하여 OECD 유사 시험법 평가기준에 따라 피부자극성 시험을 실시한 다음, 다양한 통계적 방법을 적용하여 예측력을 평가하는 것이다. 본 검증 연구를 위하여 국내 세 시험기관이 20개의 참고물질을 이용한 3차수 피부자극성 시험을 실시하였다. KeraSkin™-VM에 자극성 물질 10개, 비자극성 물질 10개을 적용하여 세포 생존율을 측정한 다음 50%를 기준으로 피부 자극성 유무를 판정하고 UN GHS 카테고리와의 판정 일치를 비교하였다. 다음 선행연구들의 통계 방법에 따라 1) Mode 판정, 2) Individual lab 판정, 3) Run sequence 다수결 판정, 4) Mispredicted test/Total 판정방법으로 KeraSkin™-VM의 예측력(민감도, 특이도, 정확도)을 산출하고, 95% Wilson's CI를 추정하였다. 또한, 실험결과를 resampling하여 예측력을 산출하는 방법으로 Simple percentile bootstrap method를 적용하였다. 세 시험기관 중 한 시험기관이 데이터의 유효성은 만족하였으나 실험실 내 재현성 검증에 실패하여 두 시험기관 또는 세 시험기관의 실험결과를 나누어 예측력을 산출하였다. 두 시험기관의 시험결과를 이용하여 예측력을 산출한 결과 1) Mode 판정에 의한 민감도 0.800 (95% CI : 0.4902-0.9433), 특이도 0.667(95% CI : 0.3542-0.8794), 정확도 0.7368(95% CI : 0.5121-0.8819), 2) Individual lab 판정에 의한 민감도 0.800(95% CI : 0.5480-0.9193), 특이도 0.650(95% CI : 0.4329-0.8188), 정확도 0.725(95% CI : 0.5717-0.8389), 3) Run sequence 다수결 판정에 의한 민감도 0.800(95% CI : 0.4902-0.9433), 특이도 0.700(95% CI : 0.3968-0.8922), 정확도 0.700(95% CI : 0.5313-0.8881), 4) Mispredicted test/Total 판정에 의한 민감도 0.800(95% CI : 0.6822-0.8817), 특이도 0.667(95% CI : 0.5406-0.7727), 정확도 0.733(95%CI : 0.6479-0.8043)로 나타났다. 세 시험기관의 실험결과를 이용하여 예측력을 산출한 결과 1) Mode 판정에 의한 민감도 0.800(95% CI : 0.4902-0.9433), 특이도 0.700(95% CI : 0.3968-0.8922), 정확도 0.750(95% CI : 0.5313-0.8881), 2) Individual lab 판정에 의한 민감도 0.800(95% CI : 0.6269-0.9049), 특이도 0.633(95% CI : 0.4551-0.7813), 정확도 0.7167(95% CI : 0.5923, 0.8149), 3) 다수결 판정에 의한 민감도 0.800(95% CI : 0.4902-0.9433), 특이도 0.700(95% CI : 0.3968-0.8922), 정확도 0.700(95% CI : 0.5313-0.8881), 4) Mispredicted test/Total 판정에 의한 민감도 0.822(95%CI : 0.7306-0.8875), 특이도 0.6556(95%CI : 0.5528-0.7455), 정확도 0.7389(95%CI : 0.6702-0.7976)로 나타났다. 실험결과를 5000회 resampling한 표본집단에 대하여 simple percentile bootstrap method로 예측력의 Median과 신뢰구간을 산출한 결과 두 시험기관일 때 민감도 0.800(95% CI : 0.800-0.800), 특이도 0.700(95% CI : 0.600-0.700), 정확도 0.750(95%CI : 0.700-0.750)이었고 세 시험기관일 때 0.800(95% CI : 0.800-0.900), 특이도 0.700(95%CI : 0.600-0.700), 정확도 0.750(95%CI : 0.700-0.800)이었다. KeraSkinTM-VM의 in vitro skin irritation test의 예측력은 통계방법에 따라 점 추정치와 신뢰구간이 상이하였다. 그 중에서 Mispredicted test/Total 판정이 연구실의 차수 별 예측결과를 확률로 모두 반영할 수 있었고, 신뢰구간의 길이도 가장 짧게 추정되었다. Simple percentile bootstrap method는 추정된 신뢰구간을 제시하는 것 외에 고 빈도 예측력 조합을 대안으로 제시해야 할 것이다.