Functional validation of candidate oncogene and tumor suppressor genes discovered from lung adenocarcinoma

Abstract

Lung cancer, the leading cause of cancer deaths worldwide, is largely classified into small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC) based on histological characteristics. Lung adenocarcinoma (LUAD), the most common subtype of NSCLC, is responsible for more than 40% of lung cancer-related deaths (Imielinski et al., 2012). The recent advances in next generation sequencing (NGS) technologies have allowed high-throughput analyses of cancer genome. This study sought to validate the candidate oncogene (U2AF1) and tumor suppressors (CLEC3B and TNNC1) discovered from a large scale sequencing project using 103 Korean lung adenocarcinoma patient samples. U2AF1 (U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1) is a RNA splicing factor. Mutations in spliceosome components have been implicated in carcinogenesis of various types of cancer. One of the most frequently found is U2AF1 S34F missense mutation. Functional analyses of this mutation have been largely limited to hematological malignancies although the mutation is also frequently seen in other cancer types including LUAD. A comparative analyses of knockdown (KD) of wild type (wt) U2AF1 and ectopic expression of two splice variant S34F mutant proteins in terms of alternative splicing (AS) pattern and cell cycle progression in A549 lung cancer cells were carried out. It was shown that induction of distinct AS events and disruption of mitosis at distinct sub-stages result from KD and ectopic expression of the mutant proteins. Importantly, when compared with the splicing pattern seen in LUAD patients with U2AF1 S34F mutation, ectopic expression of S34F mutants but not KD was shown to result in common AS events in several genes involved in cell cycle progression. Further analysis points to an active role of U2AF1 S34F mutant protein in causing chromosomal instability by inducing cell cycle dysregulation and mitotic stress. Consistently, array-CGH analysis showed that U2AF1 S34F mutant induces changes in chromosomal content including partial depletion of chromosome 2. CLEC3B (C-type lectin domain family 3 member B; Tetranectin) encodes a protein belonging to the family of C-type lectins, and TNNC1 (troponin C1, slow skeletal and cardiac type) encodes troponin C1, a component of troponin located on the actin filament. Expression of CLEC3B and TNNC1 is down-regulated in tumor tissues compared with matched normal tissues in LUAD. Overexpression of CLEC3B and TNNC1 not only inhibited cell viability, colony forming ability and cell cycle progression but also induced apoptosis in lung cancer cell lines. Importantly, these two tumor suppressor candidates appear to be inhibitory targets of EGFR-KRAS signaling pathway thus representing potentially important molecular handles for further understanding of LUAD.;폐암은 전 세계적으로 높은 사망률을 차지하는 암으로 조직형에 따라 소세포 폐암 (Small cell lung cancer; SCLC) 과 비소세포 폐암 (Non-samll cell lung cancer; NSCLC)으로 나뉜다. 특히, 비소세포 폐암에 포함되는 선암에 의한 사망률은 폐암 사망률의 40%를 차지한다 (Imielinski et al., 2012). 최근 차세대 시퀀싱 기술의 발전으로 암유전체의 고속대량분석 (high throughput analyses) 가능해졌다. 우리는 폐 선암 환자 103 명의 조직을 이용하여 고속대량분석을 진행한 결과, 암유전자 (oncogene) 후보 U2AF1과 두 암 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 후보인 CLEC3B, TNNC1을 발굴하였고, 이의 기능을 실험적으로 검증하는 것을 목적으로 하였다. U2AF1 (U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1) 은 RNA splicing factor 이다. Spliceosome 을 구성하는 단백질에서 발생하는 돌연변이 (mutation) 는 다양한 암을 일으키는 요인으로 작용한다. Spliceosome 에서 가장 빈번하게 일어나는 돌연변이 중 하나인 U2AF1 S34F 는 폐암에서도 발견되지만 그에 대한 기능 연구는 대부분 혈액암에 국한되어 왔다. 우리는 폐암 세포주인 A549 를 이용하여 U2AF1 S34F가 G2/M cell cycle arrest를 유도하는 것을 보였으며, 분열중인 세포의 염색체와 mitotic spindle을 염색하여 U2AF1 S34F가 비정상적인 염색체 분열 양상을 보이는 것을 관찰하였다. 이 염색체 불안정성 (chromosomal instability)을 검증하기 위하여 array comparative genomic hybridization (array CGH) 기술을 이용하였고, 그 결과, 우리는 U2AF1 S34F가 2번 염색체의 부분 결실을 포함한 염색체의 변화를 일으킨 것을 확인할 수 있었다. CLEC3B (C-type lectin domain family 3 member B) 는 C-type lectin에 해당되는 단백질을 발현하며 TNNC1 (troponin C1, slow skeletal and cardiac type) 는 actin filament 상에 위치하는 troponin의 구성요소인 troonin C1을 발현한다. 우리는 CLEC3B와 TNNC1이 폐 선암 환자의 정상 조직보다 종양 조직에서 발현이 낮은 것으로 RNA-seq을 통하여 확인하였고, CLEC3B와 TNNC1의 과발현이 폐암 세포주의 성장속도와 세포 주기를 늦추며 세포사멸을 유도하는 것을 관찰하였다. 중요하게도, 이 두 후보 암 억제 유전자들은 EGFR-KRAS signaling pathway을 저해하는 작용을 하는 것으로 보여, 폐 선암을 좀 더 이해하는 데에 중요한 역할을 할 것으로 기대한다.