Novel function of SH3 domain containing YSC84-like 1 in NADPH oxidase 4-mediated reactive oxygen species generation

Abstract

Nox4 isozyme is ubiquitously expressed in tissues and serves as a source of ROS generation in biological events in response to various agonists. However, no activator of Nox4 has been reported. In this thesis, I present that a novel protein SH3 domain containing YSC84-like 1 (SH3YL1) interacts and activates Nox4. Furthermore, this is demonstrated in the mouse acute renal injury model and mouse atherosclerosis model in which Nox4-mediated H2O2 plays an important role. In part I, It is found that SYLF region of SH3YL1 binds with Nox4 and SH3 domain of SH3YL1 interacts with proline-rich region (PRR) of p22phox. LPS stimulates tyrosine phosphorylation of SH3YL1 leading to formation of ternary complex of p22phox-SH3YL1-Nox4. I show that the complex induces H2O2 generation and pro-inflammatory cytokines including tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in mouse mesangial cell (MMCs). Nox4 is the predominant form in the kidney. Nox4 has been implicated in the H2O2 generation in the pathologic conditions of kidney such as acute kidney injury, chronic kidney disease and diabetic nephropathy. In this study, I show that SH3YL1 serves as a potent positive regulator of Nox4 activity in mouse acute kidney injury (AKI) model. To evaluate the role of SH3YL1 in AKI, LPS-induced AKI model in SH3YL1 KO mice has been established. WT and SH3YL1 KO mice were administered LPS intraperitoneally. After LPS injection, SH3YL1 KO mice showed lower levels of acute kidney injury biomarkers (BUN, serum creatinine and serum or urinary NGAL), decreased secretion of pro-inflammatory cytokine (TNF-α and IL-1β), decreased infiltration of macrophage and less tubular damage than wild-type mice. The results strongly suggest that SH3YL1 is involved in the renal failure in LPS-induced AKI mice. Taken together, I conclude that SH3YL1 interacts and activates Nox4-p22phox complex via tyrosine phosphorylation of SH3YL1. The formation of ternary complex of p22phox-SH3YL1-Nox4 leading to H2O2 generation induces the severity of renal failure in LPS-induced AKI model. In part II, I reveal that SH3YL1 is a positive regulator of Nox4 in vascular systems where Nox4-mediated H2O2 plays an important role. Silencing of SH3YL1 in HAECs revealed significantly inhibited H2O2 generation in response to LPS, revealed to decrease binding of p65/RelA to NFκB binding site in nucleus. Moreover, silencing of SH3YL1 in HAECs resulted in suppressed MCP-1 and ICAM-1 expression. Pretreatment of blocking antibodies against MCP-1 or ICAM-1 and transfection of siRNA to SH3YL1 into HAECs revealed in inhibited LPS-induced migration and adherence of U937 cells. These results indicate that LPS-induced migration and adherence of monocytes were mediated by MCP-1 and ICAM-1 production via sequential activation of TLR4-Nox4-SH3YL1-NFkB cascade. To explore the function of SH3YL1-Nox4 in vascular system, I established LPS-induced atherosclerosis model in mouse. ApoE KO or Nox4ApoE double knockout (DKO) mice fed with a high-fat diet (HFD) for 8 weeks. Injection of LPS to the ApoE KO mice with HFDs resulted in significantly increased atherosclerotic plaque sizes compared with the PBS-injected mice. However, injection of LPS into the Nox4ApoE DKO mice with HFDs failed to generate atherosclerotic plaque. DHE staining intensity in atherosclerotic plaques in sinus valve from LPS-injected ApoE KO mice was significantly increased compared with LPS-injected Nox4ApoE DKO. Moreover, Immunohistochemical data showed that the expression of SH3YL1 was induced in the endothelial cells of the sinus valve of ApoE mice injected with LPS, but not in the sinus valve of Nox4ApoE DKO mice. These results suggest that the increased expression of SH3YL1 is engaged in the development of atherogenesis by Nox4-mediated H2O2. Taken together, I propose that SH3YL1 regulates Nox4 activity in aortic endothelial cells. Furthermore, SH3YL1 is involved in the progression of atherogenesis by Nox4-mediated H2O2.;활성산소를 생성하는 NADPH oxidase 중에 하나인 Nox4는 생체 내 거의 모든 조직에 분포하고 있으며 다양한 자극에 의해 활성화 되어 활성산소를 생성하는 것으로 알려져 있다. 하지만 현재까지 NADPH oxidase에 대한 많은 연구가 진행되었음에도 불구하고 Nox4의 조절자나 그것의 활성기전에 대해 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 본 연구에서는 SH3YL1에 의한 Nox4 활성기전을 연구하였다. 세포 수준에서 SH3YL1의 SH3 도메인이 Nox4와 상호 작용하고 이를 통해 Nox4를 활성화 시킨다는 것을 밝혔고 더 나아가 Nox4에 의해 생성되는 H2O2가 중요한 역할을 하는 급성 신부전 모델 및 동맥 경화 모델을 마우스 수준에서 확립하여 여기에서 SH3YL1의 역할을 밝혔다. 파트1에서는 우선 세포수준에서 SH3YL1과 Nox4 그리Nox4 활성에 필수적으로 요구되는 것으로 알려진 p22phox의 결합하는 기전과 그 결합으로 인한 Nox4의 활성 조절 기전을 밝혔다. SH3YL1의 SYLF domain이 Nox4와 결합하고 있고 LPS 자극에 의해 SH3YL1의 SH3 domain에 티로신 인산화가 일어나 p22phox의 PRR (proline-rich region)과 결합함으로써 p22phox-SH3YL1-Nox4의 삼원 복합체를 형성하는 것을 확인하였다. 또한 자극에 의해 형성된 p22phox-SH3YL1-Nox4의 삼원 복합체는 마우스 간질 세포 (MMCs)에서 Nox4에 의한 H2O2 생성을 증가시켜 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 분비를 유도한다는 것을 확인하였다. Nox4는 신장에서 높은 수준으로 발현되며 Nox4에 의해 생성된 H2O2가 급성신장손상, 만성신장질환 및 당뇨병성 신증과 같은 신장 질환을 유도한다는 보고가 있다. 이 연구에서, 나는 마우스 급성신장손상 (acute kidney injury) 모델에서 SH3YL1이 Nox4 활성의 조절자로서 작용한다는 것을 보여주고자 하였다. 급성신장손상 진행에 있어 SH3YL1의 역할을 알아보기 위해 SH3YL1 결핍 마우스에서 LPS를 처리하여 급성신장손상을 유도하는 모델을 확립하였다. 야생형 및 SH3YL1 결핍 마우스에 LPS를 복강 내 투여 하였다. LPS 주사 후 야생형과 비교하였을 때 SH3YL1 결핍 마우스에서 여러 급성신장손상 생체 표지자 (혈액요소질소 (blood urine nitrogen), 혈청 크레아티닌 (serum creatinine), 혈청 NGAL (serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin), 소변 내 NGAL (urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin))가 감소되어 있는 것을 확인하였다. 또한 혈청 내, 소변 내에서 염증성 사이토사인인 TNF-α 및 IL-1β의 분비가 감소되어 있는 것도 확인하였다. 나아가 야생형 마우스와 비교하였을 때 SH3YL1 결핍 마우스에서 신장 조직 내로의 대식세포의 침윤이 감소되어 있고 신장의 관상 손상 (tubular injury)이 덜 진행되어 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 SH3YL1이 Nox4에 의한 H2O2가 관여하는 LPS로 유도한 급성신장손상 마우스의 신부전증에 연관되어 있음을 강력히 시사한다. 파트1의 내용을 종합하여 보면, 실험을 통해 SH3YL1이 SH3YL1의 티로신 인산화를 통해 Nox4-p22phox 복합체와 상호 작용하고 이로 인해 Nox4의 활성화가 일어난다는 결론을 내릴 수 있었다. Nox4에 의한 H2O2 생성을 유도하는 p22phox-SH3YL1-Nox4의 삼원 복합체의 형성은 LPS로 유도한 급성신장손상 모델에서 신부전의 진행을 유도한다는 사실을 알 수 있었다. 파트2에서는 Nox4에 의한 H2O2가 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 심혈관계에서 SH3YL1이 Nox4의 양성 조절자임을 밝히고자 하였다. 우선 사람의 대동맥 내피세포에서 SH3YL1을 knockdown 시키면 LPS에 의한 Nox4 매개 H2O2가 유의하게 억제되고, 핵 내의 NFκB 결합 부위에 대한 p65 / RelA의 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한 사람의 대동맥 내피세포에서 LPS에 의해 염증성 사이토사인인 MCP-1의 분비와 내피세포표면에 세포간부착분자인 ICAM-1의 발현이 증가하는 반면에 SH3YL1을 knockdown 시키면 MCP-1 및 ICAM-1의 발현이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 나아가 동맥경화 진행에 중요한 현상인 단핵백혈구의 내피세포 표면에 부착 (monocyte adhesion)과 내피세포사이로의 이동 (trans-endothelial migration) 또한 SH3YL1을 knockdown 시켰을 때 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 LPS에 의한 단핵백혈구의 이동과 부착이 TLR4-Nox4-SH3YL1-NFkB 케스케이드의 순차적 활성화를 통한 MCP-1 및 ICAM-1의 발현에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 심혈관계에서 SH3YL1-Nox4의 기능을 알아보기 위해 마우스에서 LPS를 주기적으로 주입하고 고콜레스테롤 식이를 먹임으로써 8주간의 장기적 염증반응을 통한 동맥경화 모델를 확립하였다. 그 결과 ApoE 결핍 마우스에서 LPS에 의해 동맥경화현상이 뚜렷하게 증가하였고, Nox4ApoE 이중결핍 마우스에서는 그러한 현상이 현저하게 줄어드는 것을 확인하였다. 또한 ApoE 결핍 마우스에서 LPS에 의해 동맥경화현상이 심화될 때에 심장에서의 sinus valve의 혈관내피세포에서 SH3YL1의 발현이 증가하는 것 또한 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 보면, SH3YL1이 대동맥 내피 세포에서 Nox4 활성을 조절하고 나아가 Nox4에 의해 생성되는 H2O2에 의한 동맥경화 진행에 관여한다는 것을 알 수 있었다.