Functional analysis of long non-coding RNA Redrum in mouse erythroid differentiation

Abstract

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are mRNA-like transcripts longer than 200nt. Many lncRNAs with significant roles in a wide variety of biological processes including regulation of gene expression, imprinting, and organ development have been found, but their regulatory mechanisms and molecular functions are in general understood at a limited level. In order to isolate lncRNAs involved in the regulation of embryonic development, I utilized deep sequencing approach and analyzed transcriptomes of the embryonic day 12.5 whole embryo and telencephalon. Multiple candidate transcripts over-represented in the whole embryo or in telencephalon have been identified. I next used RNA in situ hybridization to assess the spatiotemporal expression patterns of candidate lncRNAs. One of candidates, Redrum, was enriched in fetal liver which is the major organ for erythropoiesis during embryonic development. The tissue-specific expression was additionally confirmed by conventional PCR using multiple organs and tissues. Consistently, recent studies reported that Redrum is expressed in erythroblasts at specific substages of erythropoiesis and plays a role in promoting terminal erythroid differentiation. To determine the role of Redrum in erythropoiesis, I generated knockout mouse using the CRISPR-Cas system. Genotype of Redrum KO mouse was confirmed by Southern blot and conventional PCR. The Redrum knockout mice were grossly normal and showed no apparent developmental deficiencies. Furthermore, detailed examination of erythropoiesis using flow cytometry and in-vitro culture systems revealed that loss of Redrum expression does not lead to significant defects in differentiation of erythroid cells.;긴 비암호화 RNA (Long non-coding RNA)들은 길이가 200개의 핵산 이상 되는 전사체를 말하며 이들은 전령RNA(mRNA)와 구조적으로 매우 유사한 특성을 가지지만, 단백질을 암호화 하지 못하는 크게 구별되는 특징을 가진다. 유전자 발현 조절과 조직 발달을 포함하는 여러 생물학적 과정에 긴 비암호화 RNA가 특이적인 역할을 한다고 알려져 있지만, 이들의 자세한 조절기전과 분자적 기능은 아직까지 제한적으로 알려져 있다. 조직 발생을 조절하는 긴 비암호화 RNA를 알아보기 위해, 발생된 지 12.5일이 지난 쥐의 배아의 몸과 종뇌에서 각각 RNA를 얻어 RNA 염기서열분석 및 전사체 해독실험(Transcriptome)을 진행하였다. 이를 통해, 배아의 몸과 종뇌에서 발현되는 다양한 전사체의 후보들을 얻을 수 있었다. 후보 긴 비암호화 RNA의 조직 내에서의 시공간적 발현을 확인하기 위해 RNA in-situ hybridization 실험을 진행하였다. 여러 후보들 중에 하나인 Redrum 은 배아의 발생단계 중 적혈구 생성과정에 중추역할을 하는 기관인 간에서 특이적인 발현을 보임을 확인하였다. 이러한 조직특이적 발현은 다양한 기관과 조직을 토대로 진행한 중합효소연쇄반응에서도 확인할 수 있었다. 최근 진행된 연구에서 Redrum은 적혈구 생성 과정 중 적아세포(Erythroblast) 단계에서 세포 특이적으로 발현되고, 적혈구 분화의 마지막 과정에 중요한 역할을 할 것이라고 보고된바 있다. 적혈구 생성 과정에서 Redrum의 역할을 알아보기 위해 유전자 편집 기술 (CRISPR)을 이용하여 유전자 제거 생쥐 (Knockout mouse)를 만들었다. 쥐에서 Redrum 유전자의 결핍은 꼬리에서 얻은 유전체DNA를 가지고 southern blot과 중합효소연쇄반응을 통해 확인하였다. Redrum 유전자 결핍 쥐는 지극히 정상이었고 발생에서의 어떠한 결함도 보이지 않았다. 더욱이, 유세포분석기(FACs) 와 세포배양실험을 통해 적혈구 생성과정을 좀 더 자세히 살펴본 결과, Redrum 유전자의 결핍은 분화의 어떤 부분에도 영향을 미치지 못했다.