OCT3 프로모터 유전자 변이의 기능 검색 및 전사 조절 연구

Abstract

Organic cation transporter 3(OCT3) 수송체는 solute carrier 22A3(SLC22A3)에 의해 암호화되며, 골격근, 평활근, 간, 심장, 소장, 뇌, 태반, 침샘 등 체내에서 광범위하게 발현된다. OCT3 수송체는 다양한 유기 양이온, 신경전달물질, 그리고 메트포르민과 같은 약물의 수송에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 현재까지 OCT3의 몇 가지 유전자 변이에 대한 연구 결과가 보고되었다. 예를 들어, 유의한 루시페라아제 활성 증가를 초래하는 OCT3 근위 프로모터 변이, g.-29G>A는 간에서의 OCT3 발현 증가와 관련이 있다고 알려졌다. 또 다른 연구에서는 OCT3의 missense 변이 중 T400I와 V423F가 메트포르민의 세포 내 흡수를 유의하게 감소시키고, T44M은 이 약물의 세포 내 흡수를 증가시킨다고 보고하였다. 본 연구에서는 한국인에서 OCT3 프로모터의 유전자 변이를 발굴하고 다양한 분자실험적 실험기법을 통해 각 유전자 변이의 전사조절 기전을 밝혔다. 또한, OCT3의 기능성 변이와 제2형 당뇨병 치료를 위해 널리 쓰이는 유기 양이온 약물인 메트포르민의 약동/약력학 간의 상관성에 대해 알아보았다. 먼저, 48명의 건강한 한국인으로부터 얻은 DNA 시료를 이용한 직접염기서열분석을 통해 OCT3 프로모터 유전자 변이를 확인하였고, 이를 토대로 일배체형을 구성하였다. OCT3 프로모터 활성은 OCT3 reference 또는 변이 서열을 포함한 리포터 벡터를 HCT-116 세포에 형질주입 시킨 후 루시페라아제 리포터 분석법을 이용하여 측정하였다. 또한, ConSite와 JASPAR 프로그램을 이용하여 각 유전자 변이 부위에 결합하여 전사활성을 조절할 것으로 예측되는 전사인자를 알아보았고, 젤 지연 분석법을 통해 이러한 예측을 확인하였다. 마지막으로, 선행 메트포르민 약동학 시험에 참여하였던 45명의 건강한 한국인 임상 자료를 분석하여 OCT3 프로모터의 기능성 변이가 메트포르민의 약동학 또는 약물 반응에 미치는 영향을 알아보았다. 연구 결과, 본 연구 집단에서는 7개의 OCT3 프로모터 유전자 변이와 2개의 일배체형이 확인되었다. 그 중, 일배체형2(H2)가 reference(H1)에 비해 20.6% 유의하게 증가된 루시페라아제 활성을 보였다. 일배체형2에 포함되는 변이 중 선행연구에서 이미 알려진 g-29G>A의 루시페라아제 활성은 유의하게 증가한 반면, 역시 일배체형2에 포함되는 또 다른 두 변이, g.-1603G>A, g.-1547T>G는 유의하게 감소된 루시페라아제 활성을 보였다. 전사인자 SP1과 USF가 각각 g.-1603G>A와 g.-1547T>G 유전자 변이 부근에 결합하고, 변이 유무에 따라 결합력이 달라질 것으로 예측되었다. 이러한 예측은 젤 지연 분석법을 통해 확인되었다; 두 전사인자 모두 g.-1603G>A와 g.-1547T>G 유전자 변이 부근에 각각 결합하였고, OCT3 프로모터의 활성자인 SP1은 특히 g.-1603A 변이보다 g.-1603G reference에 더 강하게 결합하였다. 반면, USF는 g.-1547T reference보다는 g.-1547G 변이에 더 강하게 결합하였다. 임상 자료 분석결과 일배체형2에 대한 이형접합체 또는 동형접합체인 25명의 피험자로 구성된 변이군에서 대조군에 비해 메트포르민의 AUCmet(0-24), AUCmet(inf) 그리고 Cmax가 유의하게 증가함을 확인하였다(P = 0.032, 0.016, 0.031). 하지만, 메트포르민의 혈당 감소 효과는 두 군 간에 유의한 차이가 없었다. 본 연구에서는 OCT3 프로모터의 흔한 일배체형이 이 유전자의 전사에 영향을 미치며, 이는 SP1, USF에 의해 조절됨을 밝혔다. 또한, 한국인에서의 메트포르민 약동학이 이 일배체형과 상관성이 있음을 알아냈다.;Organic cation transporter 3 (OCT3) encoded by solute carrier 22A3 (SLC22A3) is expressed in various organs including the skeletal and smooth muscle, liver, heart, intestine, brain, placenta, and salivary glands in humans. It plays an important role in transporting various organic cations, neurotransmitters, and drugs such as metformin. To date, a few genetic variants have been described for OCT3. In a previous study, a variant of the OCT3 proximal promoter, g.-29G>A, showed significantly increased promoter activity that was related to increased expression of this gene in the liver. Another study reported that two missense mutations of OCT3, T400I and V423F, were associated with significantly decreased uptake of metformin, while another missense mutation, T44M, resulted in increased uptake of this drug in in vitro assays. The purpose of the present study was to identify genetic variations in the OCT3 promoter region in Koreans and determine their effects on OCT3 transcription using various in vitro assays. Next, the association between functional OCT3 variations and the pharmacokinetics or drug response of metformin, a cation drug widely prescribed for the treatment of type 2 diabetes mellitus, was analyzed. First, the OCT3 promoter region was directly sequenced using genomic DNA obtained from 48 healthy Koreans, and the haplotypes were assembled. The promoter activity of OCT3 was then measured in HCT-116 cells using a luciferase reporter assay following the construction of reporter vectors containing reference or variant OCT3 sequences. Potential binding sites for the transcription factors that can regulate OCT3 transcriptional activity were predicted using Consite and JASPAR software. Next, electrophoretic mobility shift assays were performed to validate the in silico predictions. Finally, the effect of functional OCT3 variations on metformin pharmacokinetics or drug response was determined by analyzing the clinical data obtained from 45 healthy Koreans who participated in a previous metformin pharmacokinetic study according to OCT3 promoter haplotypes. Seven variants and two major haplotypes were identified in the study population. Among them, haplotype 2 (H2) showed significantly higher (by 20.6%) luciferase activity compared to the reference. Additionally, a known variant, g-29G>A in H2 showed significantly increased promoter activity, while two variants, g.-1603G>A and g.-1547T>G, in H2 exhibited significantly decreased promoter activity. Two transcription factors, SP1 and USF, were predicted to bind to the g.-1603G>A and g.-1547T>G region, respectively, and showed very different binding affinities to the reference and variant sequences. This prediction was confirmed by electrophoretic mobility shift assays; both transcription factors could bind to the OCT3 promoter in the region of 1603G>A or g.-1547T>G. SP1, an activator of the OCT3 promoter showed higher binding affinity to the reference allele g.-1603G than to the variant allele g.-1603A, while USF showed higher binding affinity to the variant allele g.-1547G allele than to the g.-1547T reference allele. Analysis of clinical data revealed that 25 subjects who were heterozygous or homozygous for H2 showed significantly increased AUCmet(0-24), AUCmet(inf), and Cmax values for metformin compared to the reference group (P = 0.032, 0.016, and 0.031, respectively). However, the glucose-lowering effect of metformin did not significantly differ between the two groups. This study revealed that a common OCT3 promoter haplotype affects the rate of OCT3 transcription, which is regulated by SP1 and USF; this haplotype is associated with the pharmacokinetics of metformin in Koreans.