난소암 세포주의 항암제 내성을 조절하는 α-N-acetylgalactosaminidase 유전자의 기능과 발현조절 연구

Abstract

난소암은 초기 증상이 거의 없어 조기 진단이 어려울 뿐만 아니라 아직 완성된 조기 진단법도 없기 때문에 난소암 환자의 사망률은 부인과 질병 중 사망률이 가장 높다. 난소암의 사망률을 높이는 다른 이유는 약물에 대한 내성으로, 현재 많은 난소암 환자들이 주요 치료 방법으로써 백금 유래 물질을 이용한 화학적 치료를 받음으로써 생기는 원인이다. 화학적인 치료로서 주로 대표적인 백금 유래 약물인 시스플라틴(cisplatin)을 이용한다. 시스플라틴은 난소암 치료에 이용되는 대표적인 항암제이지만 다양한 후성유전학적인 변화를 통해 체내에서 내성을 일으킬 수 있다. 약물에 대한 내성이 생기면 치료를 어렵게 하여 사망률을 높이게 된다. 시스플라틴에 의한 후성유전학적인 변화의 예로는 DNA의 메틸화와 히스톤의 변화가 있다. 이러한 후성유전학적인 변화로 인해 체내에서 내성을 일으키는 유전자를 찾기 위해 다음과 같이 실험을 진행하였다. 사람유래 난소암 세포주 11가지의 항암제 시스플라틴에 대한 내성을 알아보기 위해 MTT assay를 진행하였고 IC50 값에 따라 항암제 시스플라틴 민감성 그룹에 5가지 세포주가 포함되었고, 내성 그룹에 3가지 세포주가 포함되었다. 두 그룹의 난소암 세포주의 유전자 발현의 정도와 메틸화 정도를 알아보기 위해 microarray와 Human methylation 450K bead chip을 이용하였다. 그 결과를 이용해 민감성 그룹과 내성 그룹에서의 유전자 발현의 차이가 프로모터 CpG island의 메틸화 정도에 의해 유전자의 발현이 변화되는 것이라 가정할 수 있는 유전자를 26개 찾았다. 26개의 유전자가 난소암 세포주 내에서 프로모터 CpG island의 메틸화 정도에 의해 발현이 영향을 받는지 알아보기 위해 DNA 메틸효소전달 억제제(5-aza-2′-deoxytidine)를 72시간 처리 후 유전자의 발현 변화를 정량중합효소연쇄반응(qRT-PCR)으로 관찰하였다. 그 중에서 유전자의 발현이 증가하고 항암제 민감성 그룹과 내성 그룹의 microarray 결과가 통계적으로 유의하게 차이 나는 조건을 모두 만족시킨 α-N-acetylgalactosaminidase (NAGA)유전자를 찾았다. NAGA 유전자의 프로모터 CpG island의 메틸화 정도의 변화로 인한 발현의 변화가 항암제 시스플라틴에 내성을 일으킬 것이라 가정하고, 난소암 세포주 내에서 NAGA 유전자의 발현 변화가 세포의 항암제 내성에 영향을 주는 지 알아보기 위해 항암제 민감성 그룹 세포주인 TOV-112D와 내성 그룹 세포주인 SK-OV-3를 이용하였다. 각 세포주 내의 NAGA 유전자의 발현을 변화시킨 후 MTT assay를 이용하여 IC50값을 토대로 항암제 민감도 변화를 알아보았다. 그 결과, 항암제 민감성 그룹과 내성 그룹의 세포주에서 모두 NAGA 유전자의 발현이 증가했을 경우에는 IC50값이 대조 군에 비해 감소하였고, 감소하였을 경우에는 IC50값이 증가하였다. 결과적으로, 본 연구에서는 난소암 세포주 내의 NAGA 유전자가 후성유전학적인 프로모터 CpG island의 메틸화의 변화로 발현이 조절되는 것을 알 수 있었고, 이 유전자의 발현이 적어질수록 세포의 항암제 시스플라틴에 대한 내성이 생기는 것을 알 수 있었다. 앞으로 난소암 환자에게 후성유전학적인 방법을 이용한 치료를 적용하여 사망률을 낮추고 지금보다 더 효과적인 치료를 할 수 있도록 임상연구가 더 진행되어야 할 것이다.;This study aimed to find the gene that affects cisplatin drug resistance in human ovarian cancer cell lines. Ovarian cancer is the most lethal cause of gynecological malignancies in the world. Owing to the lack of early symptoms, early diagnosis of the disease is difficult. In addition, methods for early diagnosis of ovarian cancer have not yet been established. Drug resistance is another reason associated with high mortality in ovarian cancer. Usually, ovarian cancer patients undergo chemotherapy using cisplatin. However, this drug at high dose causes side effect and drug resistance resulting from epigenetic alteration. To find out the gene that causes drug resistance because of epigenetic change, first, we classified 8 of the human ovarian cancer cell lines based on their inhibitory concentration 50(IC50) of cisplatin resistance into two groups: sensitive and resistant group. Then, we analyzed the alterations in DNA methylation of the cisplatin resistant human ovarian cancer cell lines followed by analysis of epigenetic and gene expression changes. The results obtained made us identify the NAGA gene, N-acetyl-alpha-D-galac-tosaminidase, as a cisplatin resistance biomarker in human ovarian cancer. To find the role of DNA methylation on CpG island, we used the DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidine, and analyzed the expression levels of the NAGA gene in human ovarian cancer cell lines by using real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The expression of NAGA gene was found to be upregulated by hypo-methylation on CpG island in both the groups. In addition, to identify the differential expression of the NAGA gene in the cisplatin sensitive and resistant group, we performed a microarray analysis and verified its result by qRT-PCR. We also confirmed by transfection that the alteration of NAGA gene in ovarian cancer cell lines, TOV-112D and SK-OV-3, may affect cisplatin resistance. To conclude, we found that the NAGA gene makes human ovarian cancer cell line more sensitive.