The Roles of Matrix Metalloproteinase-8 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 in Microglia-Mediated Neuroinflammation

Abstract

I. Pro-inflammatory role of MMP-8 in microglia-mediated neuroinflammation. Matrix metalloproteinases (MMPs) play important roles in normal brain development and synaptic plasticity; although, aberrant expression of MMPs leads to brain damage, including blood-brain barrier disruption, inflammation, demyelination, and neuronal cell death. Here, I report that MMP-8 is upregulated in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 microglial cells and primary cultured microglia, and inhibition of MMP-8 by its specific pharmacological inhibitor (M8I) or siRNA suppresses pro-inflammatory molecules, particularly tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) secretion. Subsequent experiments showed that MMP-8 exhibits TNF-α converting enzyme (TACE) activity by cleaving the prodomain of TNF-α (A74/Q75, A76/V77 residues) and, furthermore, that MMP-8 inhibitor suppresses TACE activity more efficiently than TAPI-0, a general TACE inhibitor. Biochemical analysis of the underlying anti-inflammatory mechanisms of MMP-8 inhibitor revealed that MMP-8 inhibitor represses MAP kinases phosphorylation, NF-κB/AP-1 activity, and reactive oxygen species (ROS) production. Further support for the proinflammatory role of microglial MMP-8 was obtained from in vivo animal models of neuroinflammatory disorders. MMP-8 is upregulated in septic conditions, particularly in microglia. Administration of MMP-8 inhibitor or MMP-8 shRNA significantly inhibits microglial activation and expression/secretion of TNF-α in brain tissue, serum, and cerebrospinal fluid of LPS-induced septic mice. These results indicate that microglial MMP-8 critically mediates neuroinflammatory disorders by modulating TNF-α activity. II. Anti-inflammatory role of TIMP-2 in microglia. Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) are known as endogenous inhibitors of MMPs. I and our group have previously reported that the expression of several MMPs (i.e. MMP-3, -8, -9) are induced by immunostimulants such as LPS and α-synuclein, and play an important role as inflammatory mediators in activated microglia. On the other hand, the expression of TIMP-2 that is constitutively expressed in microglia was significantly inhibited by treatment of LPS. However, the role of TIMP-2 in microglial activation has not been demonstrated until now. In the present study, TIMP-2 expressing plasmid or siRNA were introduced into BV2 cells and their effects on LPS-induced inflammatory reactions were examined. I found that overexpression of TIMP-2 significantly inhibited production of nitric oxide, TNF-α and ROS in LPSstimulated BV2 cells. On the other hand, knockdown of TIMP-2 augmented production of pro-inflammatory molecules. Thus, the data suggest antiinflammatory role of TIMP-2 in microglia. Further mechanistic studies revealed that TIMP-2 overexpression suppresses microglial activation via inhibition of MAP kinases, NF-κB with enhancement of Nrf2/ARE and CREB binding activities. In addition, TIMP-2 inhibited LPSinduced MMP-3, -8, -9 activities and expressions. Finally, I demonstrated that TIMP-2 exerts neuroprotective effect via inhibition of microglial activation. Therefore, modulation of TIMP-2 expression may be a potential therapeutic target for neurodegenerative diseases that are accompanied by microglial activation.;I. 소교세포가 매개하는 신경염증에서 MMP-8의 염증 작용 Matrix metalloproteinase (MMP)는 아연 의존적인 단백질분해효소로서 정상 뇌의 발달 과정과 시냅스 가소성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만 중추 신경계에서 비정상적으로 과도하게 발현되는 MMP는 뇌혈관장벽 파괴, 염증 반응, 탈수초화, 신경세포 사멸을 비롯한 뇌손상을 유발한다. 이러한 중요성에도 불구하고 소교세포 활성화에 있어서 MMP의 역할에 대한 연구는 아직까지 부족한 상태이다. 본 연구에서는 소교세포 활성화 시에 발현되는 MMP-8의 역할을 밝히고자 하였다. 일차 배양한 소교세포와 BV2 소교세포주에 면역활성물질인 LPS 처리에 의해 MMP-8의 발현이 증가함을 알 수 있었고, MMP-8의 특이적인 억제제 (M8I) 또는 siRNA를 처리한 결과, LPS에 의한 소교세포 활성화 시 분비되는 염증성 물질의 생성이 감소하였으며, 특히 TNF-α의 생성이 현저하게 감소하였다. 다양한 실험을 통해, MMP-8이 TNF-α의 전구 부위 (prodomain)의 74번 알라닌과 75번 글루타민 사이 (A74/Q75)의 결합과 76번 알라닌과 77번 발린 사이 (A76/V77)의 결합을 절단하는 TNF-α converting enzyme (TACE) 활성을 가지고 있음을 알수 있었다. 뿐만 아니라, MMP-8 억제제가 TACE의 일반적인 억제제인 TAPI-0보다 더 효과적으로 TACE 활성을 억제함을 알 수 있었다. 또한 MMP-8 억제제에 의한 항염증 기전 연구를 수행한 결과, LPS에 의한 소소 (ROS)의 생성이 MMP-8 억제제에 의해 감소하였다. 다음으로, 이와 같은 소교세포에서의 MMP-8의 염증 조절 역할을 in vivo 신경염증 질환 동물모델에서 확인하고자 하였다. LPS를 복강 내 주사하여 전신염증을 유발한 쥐의 뇌 소교세포에서 MMP-8의 발현이 증가하였으며, MMP-8 억제제 또는 MMP-8 shRNA를 투여한 결과, 뇌조직의 소교세포 활성화와 TNF-α의 발현이 현저하게 감소하였다. 뿐만 아니라, 전신염증을 유발한 쥐의 혈청과 뇌척수액에서도 MMP-8 억제제에 의해 효과적으로 TNF-α의 분비가 감소하였다. 본 연구결과를 종합하여 볼 때, 활성화된 소교세포에서 발현되는 MMP-8이 TNF-α의 활성을 조절함으로써, 신경 염증 질환에서 중요한 매개인자로서 작용함을 알 수 있었다. II. 소교세포에서 TIMP-2의 항염증 효과 Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)는 내인성의 MMP 억제제로 알려져 있다. 본 그룹에서는 선제된 보고를 통해 면역활성물질인 LPS 또는 α-synuclein 에 의해 MMP-3, -8, -9의 발현이 유도되며, 이들이 활성화된 소교세포에서 중요한 염증 매개 물질로 역할을 한다는 것을 밝혔다. 반면, 일차 배양 소교세포와 BV2 소교세포주에서 일정하게 발현하고 있는 TIMP-2의 발현이 LPS 처리에의해 현저하게 감소함을 확인하였다. 하지만 소교세포 활성화 시, TIMP-2의 역할에 대해서는 현재까지 보고된 바 없다. 본 연구에서는 TIMP-2를 과발현하는 plasmid 또는 siRNA 를 BV2 세포 안으로 도입하고, LPS 자극에 의한 염증 반응을 확인하였다. 그 결과, LPS 자극에 의한 소교세포 활성화 시 분비되는 NO, TNF-α, ROS 등 염증 매개 물질의 생성이 TIMP-2의 과발현에 의해 현저하게 감소하였다. 이와 반대로, TIMP-2 특이적인 siRNA 를 도입하여 세포 내의 TIMP-2의 발현을 억제한 결과, LPS 에 의한 염증물질 생성이 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 소교세포에서 TIMP-2의 항염증 효과를 확인할 수 있었다. 또한 상세한 기전 연구에서 TIMP-2 과발현에 의한 MAP kinase 활성과 NF-κB 의 DNA 결합 및 전사활성 억제, Nrf2와 CREB 의 DNA 결합 및 전사활성을 증가를 통해 소교세포 활성화가 억제됨을 밝혔다. 더 나아가 MMP-3, -8, -9의 활성 및 발현이 TIMP-2에 의해 감소하였다. 마지막으로 TIMP-2의 과발현에 의한 소교세포 활성화 감소로 인해 결과적으로 TIMP-2에 의한 신경보호 효과를 확인하였다. 따라서 TIMP- 2의 발현을 조절하는 것은 소교세포 활성화가 관여하는 다양한 퇴행성 신경질환의 유망한 치료 전략이 될 것이다.