Structural Analysis of Sur2391-582 and Discovery of a New ESX-Binding Core of Sur2, Sur2384-521

Abstract

HER2 is overexpressed in metastatic breast cancer and various types of cancer. HER2 is a biomarker indicating poor prognosis and high rate of recurrence. Various types of drugs targeting HER for cancer treatment have been developed. However, problematic side effects and resistances remain yet to be solved. For the most effective therapy of HER2 positive cancer, it is necessary to discover a new drug with a novel mechanism. In previous studies, it has been reported that ESX-Sur2 interaction is critical in HER2 expression. Moreover, the soluble structure of ESX in binding interface was identified and binding core of Sur2 has also been determined. However, 3D structure of Sur2 in binding interface is still unknown. To discover small molecule inhibitors against ESX-Sur2 binding, it is necessary to understand the structure of Sur2. Therefore, in this study, we experimented in various approaches for identification of Sur2 structure. As a result of NMR data analysis, a few peaks of amino acids in Sur2 construct disappeared and peaks of the spectrum were not separated well. For these reasons, we decided to design a new construct of Sur2. Using secondary structural prediction of Sur2, three kinds of Sur2 constructs were expressed. The construct with the highest expression level was selected. The construct was expressed and purified, and then tested for ESX binding. Also, we determined the buffer condition in which the protein stably maintained its structure. Under the determined conditions, NMR experiments were proceeded. Furthermore, various compounds were screened to test the possibility to be developed as an inhibitor against ESX-Sur2 interaction. As a result, a few compounds among them were expected to inhibit ESX-Sur2 binding. To summarize, in this study, the minimal binding core of Sur2 was re-established. It is expected that, using the results, development of inhibitors against ESX-Sur2 interaction will be accelerated.;HER2는 전이성 유방암을 비롯한 여러 종류의 암에서 과발현 되고, 좋지 못한 예후와 재발 가능성을 시사하는 생체 지표이다. 현재 HER2를 타깃으로 하는 다양한 종류의 약물이 개발되어 있으나, 각 약물의 부작용과 내성 발현은 아직 해결해야 할 과제로 남겨져 있다. 보다 효율적인 HER2 양성 암에 대한 치료를 위하여 HER2를 타깃으로 하는 새로운 기전의 약물 개발이 시급한 실정이다. 이전에 발표된 연구에서 ESX와 Sur2의 상호작용은 HER2의 발현에 있어서 매우 중요한 역할을 담당한다는 것이 알려져 있다. 이와 더불어 ESX 단백질 상에 존재하는 Sur2 결합 부위의 3차원적인 구조가 밝혀져 있으며 ESX와 결합에 참여하는 Sur2의 부위도 알려져 있다. 그러나 Sur2 단백질 상의 ESX 결합부위의 3차원적인 구조는 아직 밝혀지지 못하였다. ESX와 Sur2의 결합을 억제하는 저분자 의약품 개발을 위해서는 ESX의 구조뿐 아니라 Sur2의 구조에 대한 이해가 반드시 필요하므로 본 연구에서는 Sur2의 ESX 결합부위의 구조를 밝히기 위한 실험들을 진행하였다. 보고된 Sur2의 ESX 결합부위는 NMR 실험을 통한 구조 분석을 수행하기에 적합하지 못한 크기이므로 이전까지 진행된 연구에서 결합에 참여하는 더 작은 핵심 부위를 밝혔고 본 연구에서는 이를 이용하여 NMR 실험을 진행하였다. NMR 실험 결과를 통하여 Sur2 단백질의 아미노산 서열에 따른 피크 배정을 수행하였다. NMR 데이터를 분석한 결과, Sur2 단백질의 각 아미노산 잔기에 해당하는 피크가 모두 나타나지 않았고 퍼짐성도 충분히 좋지 못하여 구조를 분석하기에 적합하지 않다고 판단되었다. 이러한 이유로 새로운 Sur2 단백질의 설계가 필요하였다. Sur2 단백질의 2차 구조 예측을 통하여 세 가지 종류의 Sur2 구성을 선택하여 발현시킴으로써 가장 발현율이 높은 한 가지 Sur2 구성을 채택하였고 이를 발현, 정제하여 ESX와의 결합을 조사하고 상대적으로 안정한 상태를 유지할 수 있는 완충 용액 조건을 확립하였다. 확립된 조건 하에서 NMR 실험을 진행하였다. 또한, 여러 화합물의 ESX-Sur2 상호작용 억제제로 개발 가능성을 조사하였고 이들 중 농도 의존적으로 ESX-Sur2 결합을 억제할 것으로 기대되는 화합물을 찾았다. 본 연구를 통하여 ESX에 결합하는 Sur2의 최소 핵심 부위를 재확립할 수 있었고 실험 결과들을 토대로 ESX-Sur2 결합 억제제 개발을 가속화시킬 수 있을 것으로 기대된다.