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Preparation of modified mRNA by in vitro transcription (IVT) for protein expression

Title
Preparation of modified mRNA by in vitro transcription (IVT) for protein expression
Authors
권효경
Issue Date
2016
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
이혁진
Abstract
Messenger RNA (mRNA) is considered as an alternative genetic material in the field of gene therapy. There have been various therapeutic applications of mRNA, such as protein replacement, cancer immunotherapy, and vaccine. In this study, we aim to prepare chemically modified mRNA by in vitro transcription (IVT) and test for the simultaneous induction of target proteins in mammalian cells. There are unique advantages of mRNA delivery such as 1) no nuclear localization is required and 2) immediate protein expression can be achieved in the cytoplasm. However, in nature, unstable single strand mRNA is vulnerable to enzymatic degradation and may induce strong innate immune responses. Therefore, we tried to utilize unnatural ribonucleosides and capping reagent to prepare chemically modified mRNA. Chemical modification has resulted reduced innate immune responses and increased enzyme stability of mRNA. Finally, simultaneous delivery of multiple synthetic mRNA showed the precise control of target protein expression in the cells.;Messenger RNA(mRNA)는 유전자 치료 분야에서 매우 각광받고 있는 유전물질이다. mRNA는 항암면역치료, 백신, 단백질 대체 치료, 유전자 리프로그래밍 등 다양한 분야에 적용되어 활발한 연구가 진행되고 있다. 본 연구의 목적은 화학적으로 변형된 mRNA을 시험관내 전사 과정 (In vitro transcription, IVT)을 통해 합성 후 확인과 동시에 단백질의 발현을 세포와 체내에서 확인하고자 한다. mRNA 전달은 DNA의 전달과 달리 여러 가지 장점을 가지고 있다. 첫 번째, 전사 과정을 거치지 않기에 핵 내부로 들어갈 필요가 없고, 두 번째, 세포질 내에서 즉시 원하는 단백질의 발현이 가능하다. 그러나, 자연적으로 mRNA은 단일 가닥 구조를 가지고 있어 불안정 하며, 효소에 의해 분해되기 쉬우며 선천성 면역반응을 유도하는데, 이는 mRNA의 전달 뿐만 아니라 단백질 발현에도 영향을 미친다. 이를 개선하기 위해 자연적으로 존재하지 않는 리보뉴클레오사이드를 이용하여 화학적 변형 mRNA을 만들었다. 화학적 변형을 통해 mRNA의 선천적 면역반응의 감소와 효소에 대한 안정성을 향상 시킬 수 있었다. 또한 각각 세포와 체내에 전달 했을 시 합성된 mRNA가 효과적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었고, 이들을 동시에 전달했을 때 세포 내에서 다양한 종류의 단백질의 발현을 세포 레벨에서 조절이 가능한 것을 알 수 있었다. 이를 통해 mRNA은 유전물질로써 다양한 범위에 사용이 가능하며 특히, 치료 가능한 물질로 적용되어 그 가능성을 기대할 수 있을 것이다
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일반대학원 > 약학과 > Theses_Master
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