Mer receptor tyrosine kinase promotes resolution of acute sterile inflammation via up-regulation of liver X receptor expression and activation

Abstract

Mer 수용체(Mer)는 대식세포(macrophage)와 수지상세포(dendritic cells)에서 외부인자에 의해 유도되는 내인성 염증 반응을 억제하는데 중요한 역할을 한다. 또한 Liver X Receptor(LXRα와 LXRβ)는 면역관용(immune tolerance) 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려진 핵단백질이다. 그러나 아직까지 LXR의 내재적 활성과 전사활성 억제(transrepression) 기전이 완전히 설명되지 않고 있다. 본 연구는 zymosan 투여로 급성 무균성 염증을 유발한 생쥐 모델에서 Mer-중화 항체, Mer/Fc(Gas6 저해제)를 사용하여 Toll-like receptor 의존적 염증 반응과 LXR 활성화에 대한 Mer 신호의 역할 규명을 목적으로 한다. Mer-중화 항체를 한 시간 전 처리 후, zymosan을 복강 투여 하여 급성 무균성 염증을 유발한 생쥐에서, 투여 6, 24, 72시간 뒤에 얻은 복강대식세포와 비장, 폐에서 모두 Mer의 인산화와 하위분자인 Akt의 인산화가 억제되었다. 또한 Mer-중화 항체를 이용하여 Mer의 신호를 억제하였을 때, 복강 내의 호중구(neutrophil) 수와 단백질량이 더욱 증가하였으며, 복강세척액에서 zymosan에 의해 유도된 TNF-α, IL-1β, MIP-2을 포함한 염증 유발 인자가 모두 증가되었다. 반면 항 염증유발인자인 TGF-β1와 HGF 형성을 감소시켰다. 이러한 염증 그리고 항 염증유발 인자의 단백질 발현양상과 유사한 유전자 발현양상을 비장과 폐 조직에서도 확인하였다. Zymosan 투여 후, 복강대식세포와 비장, 폐에서 LXRα 발현은 6시간에 감소하였고, 24시간에 대조군 수준으로 회복되었으며, 72시간에 증가하였다. 또한 LXRβ 발현도 6시간에 감소하였고, 24시간에 대조군 수준으로 회복하여, 72시간은 대보군보다 약간 증가되었다. Mer-중화항체를 이용한 Mer 신호 억제는 zymosan 투여로 변화된 LXRα/β의 단백질 수준을 더 감소시켰다. LXR 의존 단백질인 ABCA1과 ApoE 유전자와 단백질 발현이 Mer-중화 항제 투여에 의해 감소됨을 확인하였다. Zymosan 투여 후, 복막세척액과 비장, 폐에서 Mer의 리간드인 Gas6 발현이 72시간까지 지속적으로 증가되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 Gas6의 증가와 더불어 Mer의 인산화도 점차 증가되는 것을 관찰하였다. Mer/Fc(Gas6 억제제)는 염증 유발 후, 6시간과 24시간 뒤의 비장과 폐 조직에서 Mer 인산화를 억제하였다. 또한 Mer/Fc에 의해 복막세척액에서 TNF-α, IL-1β, MIP-2를 포함한 염증유발 인자의 발현 수준은 더욱 증가되고, 항 염증유발인자인 TGF-β1와 HGF는 더욱 억제되는 결과를 얻었다. 뿐만 아니라 Mer/Fc를 통한 Mer 신호 억제는 복강 내 호중구 수와 단백질 수치를 더욱 증가시켰다. 마찬가지로 Gas6 의존적인 Mer 신호 억제(Mer/Fc 처리)는 비장과 폐 조직에서 LXR의 발현과 활동도(ABCA1와 ApoE 발현)를 6시간과 24시간 모두에서 감소시켰다. 추가적으로 Mer-중화항체에 의해 감소되었던 LXR의 발현과 활동도를 LXR agonist인 T0901317을 처리하여 증가시켰을 때, 복강 내 염증성 사이토카인/케모카인의 감소, 호중구 수의 감소, 단백질 수치의 감소를 6시간과 24시간 복강세척액에서 확인하였다. 결론적으로 본 연구를 통해서 Gas6 의존적인 Mer 신호 강화가 LXR활동도와 발현을 증가시킴으로써 급성 염증의 치유에 기여함을 시사한다.;Mer receptor tyrosine kinase (Mer) signal plays the central roles in the intrinsic inhibition of the inflammatory response to pathogens by macrophages and dendritic cells. Liver X receptors (LXRα and LXRβ) also have a role for the maintenance of immune tolerance. However, physiological relevance of endogenous activation and transrepression pathways has remained unclear. In the present study, we aim to understand the impact of endogenous Mer signal on Toll-like receptor (TLR)-dependent generalized inflammatory responses and LXR activation in zymosan-treated mice, using anti-Mer neutralizing antibody or a recombinant Mer extracullular domain fused to the Fc domain of human IgG (Mer/Fc), an inhibitor of growth arrest-specific gene 6 (Gas6). Treatment with anti-Mer antibody significantly reduced phosphorylation of Mer and Akt, Mer downstream molecule in peritoneal macrophages and/or spleen and lung at hours 6, 24, and 72 after zymosan treatment. Anti-Mer antibody further enhanced neutrophil number and the levels of total protein in peritoneal cavity. Moreover, anti-Mer antibody enhanced zymosan-induced pro-inflammatory mediators, including tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2), but reduced anti-inflammatory mediators, such as TGF-β1 and HGF in peritoneal fluid. Similar findings with anti-Mer antibody and zymosan were shown at the levels of genes of TNF-α, IL-1β and MIP-2, as well as TGF-β1 and HGF in spleen and lung tissue. After zymosan injection, LXRα expression in spleen and lung reduced at 6 h and reached the control level at 24 h and increased at 72 h. The level of LXRβ expression dropped at 6 h, reached to the control level at 24 h, and remained until 72 h. The levels of LXRα/β at these time points after injection of zymosan were reduced by treatment with anti-Mer antibody. The levels of genes and proteins of LXRα/β target molecules, such as ABCA1 and ApoE, were in parallel reduced by treatment with anti-Mer antibody. After zymosan injection, Gas6 expression in peritoneal lavage fluid (PLF), spleen and lung was increased over the course of inflammation. In addition to increased Gas6 protein, phosphorylation of Mer was also enhanced up to 72 h after zymosan treatment. Pretreatment with Mer/Fc significantly reduced phosphorylation of Mer at hours 6 and 24 after zymosan injection. The levels of pro-inflammatory mediators, TNF-α, IL-1β and MIP-2, in PLF were increased at 6 h and diminished to the level of baseline within 24 h after zymosan treatment. In contrast, treatment with Mer/Fc further increased expression of pro-inflammatory mediators. Anti-inflammatory mediators, TGF-β1 and HGF, also increased up to 24 h, but were inhibited by treatment of Mer/Fc. Moreover, Mer/Fc further enhanced neutrophil influx into the peritoneal cavity and the level of proteins in PLF. After zymosan injection, LXRα/β protein expression in spleen and lung reduced at 6 h and recovered the control level at 24 h. Treatment with Mer/Fc further decreased LXRα/β protein levels at 6 h, and the delayed their recovery at 24 h after zymosan treatment. In parallel, ABCA1 and ApoE protein levels were reduced at each time point. Additionally, co-administration of T0901317, a LXR agonist, with anti-Mer antibody enhanced LXRs expression and activation, and reversed the increases in these proinflammatory mediators, neutrophil numbers, and the levels of protein in peritoneal fluid at 6 and 24 h after zymosan injection. These findings suggest that Mer signaling contributes for the resolution of generalized inflammation through upregulation of LXR induction and activation.