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대장암 세포에서 상피세포성장인자 자극 하 Rab25에 의한 인테그린 베타 1의 수송에 대한 연구

Title
대장암 세포에서 상피세포성장인자 자극 하 Rab25에 의한 인테그린 베타 1의 수송에 대한 연구
Other Titles
Integrin β1 Trafficking Is Influenced by Epidermal Growth Factor Stimulation through Rab25 Pathway in Colon Cancer Cells
Authors
홍경숙
Issue Date
2016
Department/Major
대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
이령아
Abstract
연구 배경 및 목적: 인테그린(integrin)은 이형이량체 막관통 단백으로 세포외기질 단백이나 세포골격 등과 결합하여 세포부착과정에 중요한 역할을 하는 수용체이다. 단순히 세포 외 신호를 세포로 전달하는 것이 아니라 세포 내의 변화에 따라 세포 외로 그 영향을 전달하기도 하여 암화과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 이미 몇몇 고형암에서의 과발현이 보고되어 있다. 인테그린의 생성과 이동은 여러 연구를 통하여 잘 알려져 있는데 특이하게 세포막과 세포질 사이에서 재활용되어 전체 양이 크게 변화하지 않는 상태에서 세포부착과정을 조절하며 이 과정을 세포내수송(trafficking)이라고 한다. 본 연구는 대장암의 진행 과정에 관여하는 것으로 잘 알려져 있는 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)의 자극에 따라 인테그린의 발현의 변화를 확인하고 그 과정에서 세포내수송 과정이 어떤 역할을 하는지 파악하여 대장암의 진행과정에서 인테그린의 역할을 규명하고자 진행되었다. 연구 재료 및 방법: 기존의 연구에서 대장암 환자에서 증가되어 있는 것이 확인된 인테그린 베타 1을 연구 대상으로 하였다. 대장암 세포주인 HCT116 세포를 통상의 방법으로 계대배양하였다. 이를 EGF에 노출시킨 후 가장 증식이 많이 증가하는 농도와 시점을 파악하기 위해 MTT assay를 시행한 후 시간에 맞추어 채취하여(harvest) 세포막과 세포질 부분으로 단백질을 분획추출하였다. 각각의 인테그린 베타 1의 양은 웨스턴블로트법으로 확인하였다. 세포 외로 분리되는 소량의 인테그린 베타 1의 변화를 알아보기 위하여 단백질 분리를 위해 세포 채취 시 배양액을 수거하여 효소면역측정법(ELISA)으로 확인하였다. 인테그린 단백의 세포내 수송에 주 역할을 하는 Rab25를 통상의 방법으로 siRNA 형질주입법(transfection)을 사용하여 억제(knockdown) 시킨 후 인테그린 베타 1의 변화를 관찰하고 그 차이를 세포분획별로 비교 분석하였다. 연구 결과: 인테그린 베타 1의 총량은 EGF에 노출된 시간이 길수록, 그리고 EGF의 농도가 높을수록 증가하였다. 100 ng/mL의 EGF에 노출된 시간에 따라 인테그린 베타 1과 Rab25의 총 양을 측정하여 보면, 인테그린 베타 1은 노출 시간에 비례하여 16시간 째까지 증가하였으며 Rab25 역시 노출 시간에 비례하여 증가하였다. HCT116 세포가 EGF에 노출되고 24시간이 지난 이후부터는 인테그린 베타 1의 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. EGF 노출 시간에 따른 인테그린 베타 1의 분포 변화를 알아보았을 때, 세포질에서는 큰 차이가 없었던 반면 세포막에서는 감소하는 경향을 보였다(0시간 3.006, 24시간 2.980, 48시간 1.619, p = 0.013). EGF에 노출된 후 24시간 이상이 지난 시점에서 배지를 수거하여 인테그린 베타 1을 측정하였을 때, 배지의 인테그린 베타 1이 0.451 ng/mL에서 0.616 ng/mL로 증가하였다. Rab25를 억제시킨 후, 인테그린 베타 1의 총 양이 6.675에서 3.337로 감소하였는데(p = 0.003), 이 때 세포질에서는 인테그린 베타 1이 거의 탐지되지 않았고 세포막의 인테그린 베타 1의 양은 3.030에서 4.495로 증가하는 경향을 보였다(p = 0.001). 종합적으로, HCT116 세포에서 EGF 노출에 따라 인테그린 베타 1의 양은 증가하였으며, 세포막에서 EGF 노출 시간에 따라 감소하였던 인테그린 베타 1이 Rab25를 억제한 후에는 증가하는 경향을 보였다(p < 0.05). 결론: 대장암 세포에서 인테그린 베타 1은 EGF의 자극을 받아 발현이 증가하고, 세포막으로부터 세포 외 공간으로 탈락(shedding)된다. 이 과정은 인테그린의 세포내 수송에 관련되어 있는 Rab25에 의해 변화되는 것으로 세포내 수송과정의 변화로 인테그린 베타 1의 변화가 유도되는 것으로 추측되며 이 과정에 대한 면밀한 검토와 연구로 대장암의 전이과정과 진행에 대한 인테그린의 역할을 확인할 수 있을 것이다.;Background and Objectives : Integrin family is heterodimeric transmembrane protein and play an important role in cell proliferation or motility by combining with extracellular matrix protein or cytoskelton. Integrin does not only conduct the extracellular signal in cell, but also affects to extracellular environment with intracellular reactions. It is critical in carcinogenesis and, especially, the overexpression of integrin in variable solid cancers was already reported by several studies. Production and migration of integrin is well known and it is unique that total amount of integrin rarely changed through the recycling of integrins between plasma membrane and cytosol. The process of cell adherent was controlled by these mechanism, called ‘trafficking’. In this study, changes of integrin were observed after stimulation of epidermal growth factor (EGF), which was known to be related with progression of colon cancer, then the role of integrin in progression of colon cancer was tried to be investigate in that course. Subjects and Methods : Integrin β1, which is identified by previous study to increase in colon cancer patients, was chosen as the subject of study. HCT116 cells, which were human colon cancer cells, were used and successively cultured. After exposure to EGF, MTT assay was performed to grasp the concentration and the time that the proliferation of HCT116 cells was maximized, then the cells were harvested and fractionated to parts of membrane and cystosol. By Western blot, the level of integrin β1 in cytosol and membrane was measured. To identify the changes in small portion of integrin β1 which was shedded out to extracellular space, the media was also harvested and the level of integrin β1 was measured by ELISA. Rab25, which plays the important role in transport of integrin proteins was knocked down using siRNA transfection as usual maneuver, the changes of the level of integrin β1 was observed and the differences in cell fractionations were analyzed. Results : Total level of integrin β1 was increased with longer exposure-time to EGF and higher concentration of EGF. The level of integrin β1 and Rab25 was measured after exposure to 100 ng/mL of EGF, integrin β1 was increased according to the exposure-time until 16 hours and Rab25 was also increased according to the exporesure-time. When HCT116 cells were exposed to EGF after 24 hours, integrin β1 was decreased. The alteration in the distribution of integrin β1 was examined. The level of integrin β1 showed no changes in cytosol, however, it tended to decrease in membrane(0 hour 3.006, after 24 hours 2.980, after 48 hours 1.619, p = 0.013). After over 24 hours from the exposure to EGF, the media was collected and the integrin β1 was measured. The level of integrin β1 in media was increased from 0.451 ng/mL to 0.616 ng/mL. After knock-down of Rab25, total level of integrin β1 was decreased from 6.675 to 3.337 (p = 0.003). Integrin β1 was rarely detected in cytosol and it was increased in membrane from 3.030 to 4.495 (p = 0.001). Overall, in HCT116 cells, the level of integrin β1 was increased and the level of integrin β1 in membrane, which was decreased with longer exposure-time to EGF, tended to increase after knock-down of Rab25 (p < 0.05). Conclusions : In colon cancer cell, integrin β1 multiplied by the stimulation of EGF, was shedded from membrane to extracellular space. This process was controlled by Rab25, which was related to the trafficking of integrin β1. It is assumed that the alterations in trafficking of integrin β1 induced to change the distribution of that. If further studies and close reviews about this process will help to understand the role of integrin β1 in the progression and metastasis of colon cancer.
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