The action mechanism of anti-fibrosis and anti-cancer activities of EW-7197, an activin receptor-like kinase 5 inhibitor, in lung, kidney and liver fibrosis, and liver cancer experimental models

Abstract

Transforming growth factor-β (TGF-β) plays essential roles in regulation of the epithelial and neural tissue system, the immune system, and wound repair. As up-regulated TGF-β signaling is characteristic of various human diseases, especially fibrosis and cancer, the present study developed a novel small molecule inhibitor of the TGF-β type I receptor kinase (ALK5), EW-7197, as an effective approach for prevention and treatment of fibrosis and cancer. Fibrosis results from chronic tissue damage and causes significant organ dysfunction. It greatly enhances the risk of subsequent cancer development. To develop anti-fibrotic therapeutics, the present study evaluated the therapeutic potential of EW-7197 in carbon tetrachloride (CCl4) mouse, bile duct ligation (BDL) rat, bleomycin (BLM) mouse, and unilateral ureteral obstruction (UUO) mouse models. In vivo anti-fibrotic activities of EW-7197 were examined by microarray, immunohistochemistry, western blotting, and a survival study in the animal models. EW-7197 decreased the expression of fibrotic markers, mesenchymal markers, extracellular matrix (ECM) remodeling markers, and oxidative stress-related markers in the livers of CCl4 mice and BDL rats, in the lungs of BLM mice, and in the kidneys of UUO mice. Furthermore, EW-7197 extended the lifespan of CCl¬4 mice, BDL rats, and BLM mice. The mechanism of EW-7197 appeared to be blockade of both TGF-β1/Smad2/3 and reactive oxygen species (ROS) signaling to exert an anti-fibrotic activity. This study shows that EW-7197 has a strong potential as an anti-fibrosis therapeutic agent via inhibiting TGF-β-/Smad2/3 and ROS signaling. TGF-β signaling plays a key role in progression and metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC). This study was undertaken to gain the proof of concept of EW-7197 as a potent anti-cancer therapy for HCC. The present study identified tissue inhibitors of metalloproteinases-1 (TIMP-1) as one of the secreted proteins of hepatic stellate cells (HSCs) and a key mediator of TGF-β-mediated crosstalk between HSCs and HCC cells. TGF-β signaling led to increased expression of TIMP-1, which activates focal adhesion kinase (FAK) signaling via its interaction with CD63. Inhibition of TGF-β signaling using EW-7197 significantly attenuated the progression and intrahepatic metastasis of HCC in an SK-HEP1-Luc orthotopic-xenograft mouse model. In addition, EW-7197 inhibited TGF-β-stimulated TIMP-1 secretion by HSCs as well as the TIMP-1-induced proliferation, motility, and survival of HCC cells. Further, EW-7197 interrupted TGF-β-mediated epithelial-mesenchymal transition (EMT) and Akt signaling, leading to significant reductions in the motility and anchorage-independent growth of HCC cells. In conclusion, the present study found that TIMP-1 mediates TGF-β-regulated crosstalk between HSCs and HCC cells via FAK signaling. In addition, EW-7197 demonstrates potent in vivo anti-cancer therapeutic activity and may be a potential new anti-cancer drug of choice to treat patients with liver cancer. In summary, a novel small molecule ALK5 inhibitor, EW-7197, has an anti-fibrosis and anti-cancer efficacy in vitro and in vivo. This study has demonstrated that the inhibition of TGF-β signaling by EW-7197 may be a promising therapeutic strategy for fibrosis and cancer.;TGF-β는 다양한 생리활성을 지닌 cytokine으로, 상피세포 및 신경세포의 발달, 면역시스템의 조절, 상처치유 등에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. TGF-β 신호체계는 섬유화 질환 및 암 질환과 같은 다양한 질환에서 활성화 되어있고, 질환 진행에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 신규 TGF-β type I 수용체(ALK5) 저해제인 EW-7197을 이용하여 TGF-β 관련 질환에 대한 치료 활용가능성을 살펴보고자 하였다. 섬유화는 만성적인 세포 손상으로 인해 일어나며, 치명적인 조직 기능 장애를 초래한다. 이러한 과정은 암 질환 등의 다른 질환의 발생을 유도한다. TGF-β가 다양한 기전을 통하여 섬유화 질환의 발생 및 진행에 중요하게 작용한다는 점에 기인하여, 다양한 섬유화 동물 모델에서 EW-7197을 이용하여 TGF-β의 저해를 통한 항섬유화 작용을 보고자 하였다. 다양한 장기 섬유화에 대한 기전을 보기 위하여 CCl4 또는 BDL을 이용한 간 섬유화 동물 모델, UUO를 이용한 신장 섬유화 동물 모델, BLM을 이용한 폐 섬유화 동물 모델을 사용하였다. 마이크로어레이, 면역조직화학, 단백질 및 mRNA 발현 비교, 동물 모델의 생존 기간 비교 등과 같은 다양한 실험 방법을 이용하여 EW-7197을 통한 섬유화 동물 모델에 대한 항섬유화 효능을 확인하였다. 섬유화 동물 모델에서 EW-7197에 의하여 세포외기질, 간엽세포의 지표, 세포외기질의 개조에 연관된 지표, 산화스트레스 지표의 발현량이 감소하는 것을 통해, EW-7197에 의한 항섬유화 효과를 확인할 수 있었다. 또한 섬유화 동물 모델의 EW-7197에 의한 생존 연장을 통하여 EW-7197의 항섬유화 효능을 다시 한 번 확인하였다. EW-7197의 항섬유화 작용에 대한 기전은 다양한 세포 기반 실험을 통하여 확인하였으며, TGF-β 신호체계 및 ROS 신호체계에 대한 효과적인 억제를 통한 작용임을 확인하였다. 이로써 EW-7197를 이용한 TGF-β 억제는 새로운 항섬유화 치료법으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. TGF-β는 섬유화뿐만 아니라 암 질환 진행에도 중요한 작용하는 cytokine으로, 특히 간암에서 그 작용이 큰 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 TGF-β 억제를 통한 새로운 간암 치료에의 활용 가능성을 살펴보기 위하여, SK-HEP1-Luc 세포를 이종 이식한 간암 동물 모델에서 EW-7197의 항암 효능을 평가하였다. 본 연구를 통해 TIMP-1이 활성화된 HSC와 HCC 세포간의 상호작용을 매개하는 인자임을 확인하였다. 또한 TIMP-1을 통한 상호작용이 간암의 진행 및 전이를 촉진하는 것을 확인하였고, 세포 기반 실험을 통해 FAK, Akt 등과 같은 다양한 하위 신호체계를 기반으로 한 작용임을 확인하였다. 또한 EW-7197이 HCC 세포에 대한 직접적인 작용을 통해서도 간암의 진행 및 전이를 억제한다는 것을 확인하였다. 본 연구를 통하여 EW-7197이 직간접적으로 간암의 진행 및 전이를 억제하는 것을 확인하였고, 이는 EW-7197의 항암제로서의 가능성을 시사한다고 볼 수 있다. 이상의 결과들로부터, 신규 ALK5 저해제인 EW-7197은 섬유화 질환과 암 질환에 탁월한 치료작용을 가진 신규 항섬유화 및 항암 후보 물질로 사료된다.