The mechanistic study of EW-7197, an activin like kinase 5 (ALK5) inhibitor, in cholestatic liver fibrosis

Abstract

Primary biliary cirrhosis (PBC) is a chronic cholestatic liver disease, affecting middle aged females in Korea and around the world today. Biliary liver cirrhosis frequently can lead to scarring, fibrosis and cirrhosis. However, the exact cause of PBC is unknown and there is an urgent need to develop more effective therapeutic approaches for prevention and treatment of PBC. In this study, I have tried to evaluate the ability of a novel activin-like kinase 5 (ALK5) inhibitor, EW-7197, to inhibit the activation of hepatic stellate cells (HSCs), epithelial mesenchymal transition (EMT), hypoxia and ROS signaling for biliary liver fibrosis therapy. In response to injury, HSCs are activated into myofibroblasts and become a major source of extracellular matrix (ECM) proteins in fibrotic progression. And transforming growth factor-β (TGF-β) plays a key role among transdifferentiation of HSCs to myofibroblasts and EMT. Therefore the blockade of TGF-β signaling may thus be a novel strategy for treatment of PBC. In this study, I have evaluated the anti-fibrotic effects and the inhibition ability of a novel ALK5 inhibitor, EW-7197, on biliary liver fibrosis on bile duct ligation-operated (BDL) rat model in vivo and immortalized human HSCs cell line LX-2 cells in vitro. EW-7197 effectively blocked TGF-β signaling, as detected by inhibition of TGF-β mediated Smad2/3 phosphorylation both in vivo and in vitro. TGF-β stimulates upregulation of activation marker of HSCs as α-smooth muscle actin (α-SMA), and increases mesenchymal markers of EMT such as N-cadherin, vimentin including master regulator such as Snail. TGF-β also induced extracellular matrix (ECM) protein like type I collagen (Col1) and the hypoxia and reactive oxygen species (ROS) signaling. Hypoxia is an environmental factor that aggravates biliary liver fibrosis by trigger effect on ROS. I found upregulation of hypoxia inducible factor 1α (HIF1α), glucose transporter 1 (GLUT1) and carbonic anhydrase IX (CAIX) that represent marker of hypoxia in liver of BDL rat. Furthermore, to confirm that hypoxia effect on HSCs, LX-2 cells were treated chemical hypoxia mimic agent, CoCl2. Hypoxia mimic condition activates HSCs by stimulation of α-SMA and HIF1α. And CoCl2 increase the expression of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), which plays key role in fibrotic progression. And CoCl2 increase markers of EMT and ECM, and upregulates mRNA levels of TGF-β. All these effect of CoCl2 were efficiently inhibited by EW-7197. In BDL rats, oxidative stress is considered to be the result of TGF-β and hypoxia, confirmed by elevated expression of 4-hydroxy-2,3-nonenal (4HNE) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 (NOX4). In response to ROS, LX-2 treated with glucose oxidase (GOX) increase expresssion of α-SMA and Col1, then treatment of EW-7197 can reduce the GOX induced ROS level as ROS scavangers. Furthermore, peroxiredoxin I (Prdx I), an antioxidant is elevated in BDL rats and relieved by EW-7197. In isolated primary HSCs enriched cells from Prdx I-/- mouse showed that antioxidant ability of EW-7197 must be related with Prdx I. TGF-β, ROS signaling and the EMT to accelerate the progression of fibrosis. All these Effect of TGF-β were efficiently abrogated by EW-7197. In vivo, treatment with EW-7197 significantly suppressed expression on Col1 of BDL rat liver, as evidenced by the reduction of ECM accumulation. The anti-fibrotic effect of EW-7197 in liver tissues and HSCs were investigated by biochemical assay, immunohistochemistry (IHC), immunofluorescence (IF), chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, real time polymerase chain reaction (RT-PCR) or western blot assay. These anti-fibrotic effects of EW-7197 were associated with downregulation of α-SMA such as marker of HSC activation, N-cadherin or vimentin as mesenchymal markers and Col1 as ECM marker. In BDL-rat model, orally given EW-7197 inhibited fibrosis and attenuated HIF1α-induced activation of HSCs and EMT. Also EW-7197 inhibited HIF1α derived HSC activation and expression of EMT markers in LX-2 cells. Taken together, these data suggest that EW-7197, is a novel promising therapeutic agent with potent anti-fibrotic effects against biliary liver fibrosis.;원발성 담즙성 간경변증은 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 주로 40-50대 중년 여성을 대상으로 발병하는 만성적인 담즙 정체성 간질환이다. 원발성 담즙성 간경변증은 간질환의 이환율과 사망률에 직접적으로 관계되는 섬유화와 간경화로 진행되는 질환이기 때문에 많은 연구자들의 관심이 집중되고 있다. 그러나 현재까지 이 질환은 면역 반응과 관련이 있다는 것 이외의 정확한 발병 원인조차 알려져 있지 않다. 원발성 담즙성 간경변증의 치료 및 예방을 위한 다양한 연구가 진행 중이지만 그 효과는 만족할 만하지 않은 수준이어서 이 질환의 예방과 치료를 위한 새롭고 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있다. 이에 본 연구에서는 담즙성 간섬유화 동물 모델과 간성상세포에서 신규 TGF-β type I 수용체 (ALK5) 저해제인 EW-7197의 항섬유화 효능을 평가하여 새로운 담즙성 간섬유화 치료제로서의 활용 가능성을 살펴보았다. 간성상세포는 간 손상에 반응하여 세포외 기질을 생성하며 섬유화를 진행시키는 주요한 세포로 알려져 있는데, TGF-β는 간성상세포의 근섬유아세포로의 전환분화와 상피간엽이행에서 중요한 역할을 하는 cytokine이기 때문에 만성적인 간 질환에서 TGF-β신호를 차단하는 것은 간 섬유화 치료에 가장 이상적인 방법으로 알려져 있다. 따라서 EW-7197을 통한TGF-β 신호 저해는 새로운 원발성 담즙성 간경변증의 치료 전략으로 사료된다. 본 연구는 원발성 담즙성 간경변증에 대한 EW-7197의 ALK5 저해 능력과 항섬유화 효능 규명을 위하여 간섬유화 동물모델들 중에서 담즙성 간경변을 대변할 수 있도록 담관 결착을 통하여 담즙성 간 섬유화를 유도한BDL 모델을 사용하였다. 또한 본 연구에서는 마우스 일차간세포 분리를 통하여 hepatocyte와 간성상세포를 분리하여 TGF-β 를 처치하였을 때 간성상세포에서만 상피간엽이행이 유도되는 것을 확인하였고 간성상세포주인LX-2를 주요 세포실험에 사용하였다. EW-7197은 동물 모델과 세포 모두에서 TGF-β 에 의해 유도된 Smad2/3 인산화를 저해하며 TGF-β 신호를 억제하였다. 본 연구에서TGF-β는 상피 세포 마커인 E-cadherin의 발현을 저해시키며, 간성상세포 활성화의 마커인 α-SMA과 N-cadherin, vimentin 같은 상피간엽이행의 간엽 마커와 그의 주요 조절자인 Snail과 세포외 기질 마커인 type I collagen (Col1) 발현을 증가시켰으며, 저산소증과 활성산소 신호 또한 증가시켰다. 저산소증은 담즙 정체성 질환에서 흔히 관찰되는 현상으로 연쇄적으로 산화 스트레스를 발생시켜 간성상세포의 활성화를 촉진하여 섬유화를 악화시키는 요인으로 잘 알려져 있는데 담즙성 간 섬유화를 유도한 BDL 모델의 간에서도 Hypoxia inducible factor 1 α (HIF1α)의 발현으로 대변되는 저산소증이 관찰되었으며 glucose transport 1(GLUT1)과 carbonic anhydrase IX(CAIX)과 같은 저산소증의 마커 발현이 증가되는 것이 확인되었다. 또한 LX-2 세포에HIF1α의 안정화에 기여하여 화학적으로 저산소증 유사 환경을 조성하는 물질인 CoCl2 를 처치하여 간성상세포에서 저산소증의 영향을 확인하였다. CoCl2 는 LX-2세포에서 HIF1α와 α-SMA 의 발현을 높였으며, 섬유화의 진행에 중요한 역할을 하는 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) 의 발현 또한 높였으며 상피간엽이행의 간엽 마커와 조절자인 Snail과 세포외기질인 Col1의 발현도 증가시켰다. 또한 CoCl2 는 LX-2와 BDL 모델 모두에서TGF-β의 mRNA 발현을 증가시켰으나 이러한 작용들은 EW-7197처치에 의하여 효과적으로 억제되었다. 또한 담즙성 간섬유화 BDL모델의 간에서 TGF-β와 HIF1α에 의하여 ROS가 증가되어 있음을 lipid peroxidation의 산물인 4-hydroxy-2,3-nonenal (4HNE)와 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 (NOX4) 발현 증가로 확인하였다. EW-7197이 ROS에 미치는 영향을 알아보기 위하여LX-2 세포에 배지의 glucose를 지속적으로 산화시켜 H2O2를 만들어내는 glucose oxidase (GOX)를 처치하여 실험을 수행한 결과 간성상세포가 활성화되고 Col1과 같은 세포외기질의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며 EW-7197의 처치가 ROS에 의한 위의 작용들을 억제하는 것을 확인하였다. 산화적 스트레스가 높아져 있는 BDL 모델의 간에서는 antioxidant인 peroxiredoxin I(PrdxI)의 발현이 증가되어 있었고 EW-7197 투여에 의하여 Prdx I의 발현이 감소되는 것으로 확인되었다. 증가된 산화 stress에 작용하는 EW-7197의 효과를 알아보기 위하여 유전적으로 변형되어 Prdx I 이 제거된 mouse의 간에서 간성상세포를 분리하여 TGF-β와 GOX를 처치하는 실험을 수행하였다. Prdx I이 제거된 mouse의 간성상세포는 Prdx I이 존재하는 mouse에 비하여 TGF-β와 GOX에 의해 유도된α-SMA 발현 억제에 대한 EW-7197의 작용이 미미한 결과를 보여 EW-7197의 산화적 stress에 대한 작용에 Prdx I이 관여할 것이라는 단서를 얻을 수 있었다. 이러한 결과들을 종합하여 EW-7197은 담즙성 간섬유화에서 TGF-β 신호와 HIF1α에 의한 간성상세포의 활성화 및 상피간엽이행과 ROS를 억제하는 효능을 지녔으므로 새로운 담즙성 간섬유화 치료제로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다.